Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants
Summary
Gerichte afbraak van eiwitten is een belangrijke regulerende mechanisme voor de celfunctie. Het komt via een geconserveerde ubiquitineproteasoomroute, die polyubiquitine ketens hecht aan het doeleiwit dat dan als moleculaire "labels" voor het 26S proteasoom. We beschrijven hier een eenvoudige en betrouwbare celvrije assay voor proteasomale afbraak van eiwitten.
Abstract
De ubiquitine-proteasoom route voor eiwitafbraak voren gekomen als een van de belangrijkste mechanismen voor het regelen van een breed scala van cellulaire functies in bijna alle eukaryote organismen. Specifiek, in planten, het ubiquitin/26S proteasoom systeem (UPS) regelt eiwitafbraak en draagt aanzienlijk bij tot de ontwikkeling van een groot aantal processen, waaronder immuunrespons, ontwikkeling en geprogrammeerde celdood. Bovendien, en meer gegevens suggereren dat een groot aantal planten ziekteverwekkers, zoals Agrobacterium, exploiteren de host-UPS voor efficiënte infectie, met nadruk op het belang van UPS in plant-pathogeen interacties.
De substraatspecificiteit van UPS wordt bereikt door E3 ubiquitin ligase dat werkt in samenhang met de E1 en E2 ligasen herkennen en markeren specifieke eiwitmoleculen voor afbraak bestemde met daaraan verbonden ketens van ubiquitine moleculen. Een klasse van de E3 ligasen is het SCF (SKP1 / CUllin / F-box eiwit)-complex, dat specifiek de UPS substraten en richt ze voor ubiquitination via de F-box eiwit component. Om een mogelijke rol van UPS in een biologisch proces plaats te onderzoeken, is het belangrijk om een eenvoudige en betrouwbare test voor UPS-gemedieerde eiwitafbraak bedenken. We beschrijven hier een dergelijke test met behulp van een plant-cel-vrij systeem. Deze test kan worden aangepast voor studies van de rol van gereguleerde eiwitafbraak bij diverse cellulaire processen, met een speciale focus op de F-box eiwit-substraat interacties.
Introduction
De ubiquitin/26S proteasoomroute is in opkomst als een wijdverbreid mechanisme voor de controle van diverse biologische reacties, waaronder transcriptionele regulatie, cel-cyclus progressie en signaaltransductie, receptor down-regulering of endocytose, onder andere verwerkt 1-4. In deze route, is het doelwit eiwit gelabeld door ubiquitine residuen die het eerst worden aangesloten via een thiolester binding met ubiquitine-activerend enzym E1 en vervolgens translocatie naar een cysteïne aminozuur residu van ubiquitine-conjugatie enzym E2, eindelijk, E2 interageert met ubiquitinligase E3 , waardoor polyubiquitinatie van het eiwit substraat. Uiteindelijk worden de polyubiquitinated eiwitten herkend en afgebroken door het 26S proteasoom. In dit mechanisme, de E3 enzym specificeert de ondergrond en fungeert als de belangrijkste regelgevende component van de ubiquitin/26S proteasoom systeem (UPS). E3 ligasen onafhankelijk optreden, zoals RING domein ligasen, of als onderdeel van een multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box proteïne)-complex, zoals F-box domein ligases. SCF-gemedieerde proteasomale afbraakroutes zijn betrokken bij de regulatie van transcriptie, celcyclus, signaaltransductie 5-10 en vele andere belangrijke cellulaire functies.
Naast deze kritische rol bij de regulatie van cellulaire processen, UPS duurt het centrale podium in veel plant-pathogeen interacties. Bijvoorbeeld meer gegevens suggereren dat verschillende planten pathogenen, waaronder Agrobacterium tumefaciens, vertrouwen op de host UPS voor om de infectie proces 11 te vergemakkelijken. Agrobacterium lokt neoplastische groei op planten, zijn natuurlijke gastheren te vertegenwoordigen, en het kan ook veranderen diverse andere eukaryoten, van schimmels 1,2 tot menselijke cellen 12,13. Tijdens de infectie, Agrobacterium exporteert een DNA-element (T-DNA) en verscheidene virulentie (Vir) proteïnen in de gastheercel 12-13. Een van deze eiwitten is VirF, de eerste F-box eiwit gevondenwordt gecodeerd door een prokaryote genoom 14. Als onderdeel van de SCF ubiquitine ligase complex VirF De praktisch gastheer homoloog VBF 15 vergemakkelijken Agrobacterium infectie via de UPS-gemedieerde eiwitafbraak, die vermoedelijk vergemakkelijkt uncoating van de binnenvallende bacterieel T-DNA van de bijbehorende bacteriële en gastheereiwitten, VirE2 en VIP1, respectievelijk 16,17. Interessant is dat veel F-box eiwitten, waaronder VirF, intrinsiek onstabiel vanwege hun proteolyse, wat gemedieerd door autoubiquitination activiteit 18,19 of andere E3 ligasen waarvoor F-box eiwitten als substraten 20-23 dienen.
Bij het bestuderen van biochemische activiteiten van F-box eiwitten, met ubiquitine ligasen en / of hun substraten, zou het zeer nuttig zijn om een eenvoudige en betrouwbare test voor proteasomale degradatie gebruiken. Hier beschrijven we een dergelijk protocol voor de analyse proteïne stabiliteit in een cel-Vrij systeem. In deze bepaling wordt de stabiliteit van de UPS substraat geanalyseerd in de aanwezigheid of afwezigheid van een van de essentiële componenten van de proteasomale afbraak route, zoals een F-box eiwit in een celvrij systeem. Over het algemeen spreken wij de geteste eiwit (s) in plantaardige weefsels, bereiden cel-vrije extracten uit deze weefsels en toezien op de hoeveelheden van het eiwit (s) van belang door western blotting. De UPS-afhankelijk mechanisme van eiwitdegradatie wordt aangetoond door opname van specifieke proteasomale remmers en / of met co-expressie van dominant-negatieve vorm van SCF component, Cullin. Terwijl wij illustreren deze assay gebruikt proteasomale afbraak van de Arabidopsis VIP1 17 eiwit door de F-box eiwit VBF 15 kan worden toegepast om de stabiliteit van andere proteasomale substraten te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze test berust op de expressie van de geteste eiwitten in plantenweefsels, dus de potentiële proteasomale afbraakproces uiteraard het reeds in het levende weefsel. We assay eiwit destabilisatie echter alleen in de extracten met tijdstip nul monster die als eerste referentiepunt. Daarom definiëren we als een celvrij assay.
Éen belangrijk aspect van het succes van deze test is de juiste keuze van de expressievector waarvan de geteste eiwitten (s) geproduceerd. Behoudens specifieke antilic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De werkzaamheden die leiden tot deze publicatie heeft financiering ontvangen van de Marie Curie COFUND programma "U-Mobility", medegefinancierd door de Universiteit van Malaga en de Europese Unie 7e kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder GA nummer 246550. Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD en BSF naar VC
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
