Le dosage de la dégradation par le protéasome dans un système exempt de cellules dans les plantes

Summary

Dégradation de la protéine ciblée représente un mécanisme de régulation important pour la fonction cellulaire. Il se produit par une voie ubiquitine-protéasome conservée, qui attache chaînes polyubiquitine à la protéine cible qui servent alors des "tags" moléculaires pour le protéasome 26S. Ici, nous décrivons un test simple et fiable sans cellule de la dégradation par le protéasome des protéines.

Abstract

La voie ubiquitine-protéasome de dégradation des protéines a émergé comme l'un des mécanismes les plus importants pour la régulation d'un large éventail de fonctions cellulaires dans pratiquement tous les organismes eucaryotes. Plus précisément, dans les plantes, le système de protéasome ubiquitin/26S (UPS) régule la dégradation des protéines et contribue de manière significative au développement d'une large gamme de procédés, y compris la réponse immune, de développement et de la mort cellulaire programmée. En outre, en plus de preuves suggère que de nombreux agents pathogènes des plantes, comme Agrobacterium, exploitent les UPS d'accueil pour une infection efficace, soulignant l'importance de l'UPS dans les interactions plante-pathogène.

La spécificité de substrat de l'onduleur est obtenue par l'ubiquitine-ligase E3 qui agit de concert avec le E1 et E2 ligases de reconnaître et de marquer les molécules de protéines spécifiques destinés à la dégradation par la fixation sur les chaînes de molécules d'ubiquitine. Une classe des ligases E3 est l'EFC (Skp1 / Cprotéine Ullin / F-box) complexe, qui reconnaît spécifiquement les substrats UPS et les objectifs pour l'ubiquitination via son composant de la protéine F-box. Pour étudier le rôle potentiel de l'UPS dans un processus biologique d'intérêt, il est important de mettre au point un test simple et fiable pour la dégradation des protéines UPS médiation. Ici, nous décrivons un tel dosage en utilisant un système sans cellule végétale. Ce test peut être adapté pour des études sur les rôles des réglementée dégradation des protéines dans divers processus cellulaires, avec un accent particulier sur les F-box interactions protéine-substrat.

Introduction

Le protéasome ubiquitin/26S est en train de devenir un mécanisme généralisé pour le contrôle de diverses réactions biologiques, y compris la régulation transcriptionnelle, la progression du cycle cellulaire et la transduction du signal, le récepteur régulation à la baisse ou l'endocytose, entre autres procédés ^1-4. Dans cette voie, la protéine cible est marquée par ubiquitine résidus qui sont d'abord fixés par l'intermédiaire d'une liaison thiolester d'enzyme ubiquitine-activation E1 et ensuite transporté vers un résidu d'acide aminé cystéine de l'ubiquitine-enzyme de conjugaison E2, enfin, E2 interagit avec l'ubiquitine ligase E3 , entraînant une polyubiquitination du substrat protéique. En fin de compte, les protéines polyubiquitinées sont reconnues et dégradées par le protéasome 26S. Dans ce mécanisme, l'enzyme E3 spécifie le substrat et agit en tant que composant clé de régulation du système de protéasome ubiquitin/26S (UPS). Ligases E3 peuvent agir indépendamment, comme ligases de domaine RING, ou dans le cadre d'un SCF unités multiples (S) complexe protéique kp1/Cullin/F-box, tels que F-box ligases de domaine. SCF-médiation voies de dégradation par le protéasome sont impliquées dans la régulation de la transcription, le cycle cellulaire, la transduction du signal ^5-10 et bien d'autres fonctions cellulaires majeurs.

Outre ces rôles essentiels dans la régulation des processus cellulaires, UPS prend l'étape centrale dans de nombreuses interactions plante-pathogène. Par exemple, en plus de preuves suggère que plusieurs agents pathogènes des plantes, y compris Agrobacterium tumefaciens, s'appuient sur ​​les UPS d'accueil pour faciliter le processus d'infection ^11. Agrobacterium provoque des tumeurs néoplasiques sur les plantes, qui représentent ses hôtes naturels, et il peut également transformer une large gamme d'autres eucaryotes, les champignons de ^1,2 à ^12,13 cellules humaines. Au cours de son infection, Agrobacterium exporte un élément d'ADN (ADN-T) et de plusieurs protéines de virulence (vir) dans la cellule hôte ^{de 12 à 13.} Une de ces protéines est VirF, la première protéine F-box trouvéêtre codée par un génome de procaryote ^14. Dans le cadre du complexe SCF ubiquitine ligase, VirF, et son homologue de l'hôte fonctionnel VBF ^15, faciliter l'infection par Agrobacterium via la dégradation des protéines UPS médiée, ce qui facilite probablement la décapsidation de l'ADN-T des bactéries envahissent de ses protéines bactériennes et d'accueil d'accompagnement, VirE2 et VIP1, respectivement ^16,17. Fait intéressant, de nombreuses protéines F-box, y compris VirF, sont intrinsèquement instables en raison de leur propre protéolyse, qui est médiée par l'activité de autoubiquitination ^18,19 ou par d'autres ligases E3 pour lesquels les protéines F-box peuvent servir de substrats ^{de 20 à 23.}

Lorsque l'on étudie l'activité biochimique des protéines F-box, d'autres ligases ubiquitine, et / ou leurs substrats, il serait très utile d'utiliser un test simple et fiable pour la dégradation par le protéasome. Nous décrivons ici un tel protocole pour l'analyse de la stabilité de la protéine dans une celluleSans système. Dans cet essai, la stabilité du substrat UPS est analysée en présence ou en l'absence de l'un des composants essentiels de la voie de dégradation par le protéasome, comme une protéine F-box, dans un système acellulaire. En règle générale, on exprime la protéine (s) testé dans les tissus végétaux, de préparer des extraits acellulaires à partir de ces tissus et de contrôler les quantités de la protéine (s) d'intérêt par western blot. Le mécanisme de l'onduleur dépendant de la dégradation des protéines est mise en évidence par l'inclusion d'inhibiteurs de protéasome spécifiques et / ou en utilisant la co-expression de la forme négative dominante d'un composant d'SCF, Cullin. Alors que nous illustrons ce dosage en utilisant la dégradation par le protéasome de la protéine Arabidopsis VIP1 ¹⁷ par la protéine F-box VBF ^15, elle peut être utilisée pour étudier la stabilité de tous les autres substrats du protéasome.

Protocol

Une. L'expression des protéines Choix du système d'expression Sélectionnez le système, c'est à dire, des vecteurs et la méthode de délivrance de vecteur, le mieux adapté pour l'expression de la protéine d'intérêt dans l'organisme modèle / cellule spécifique. A noter que notre dosage nécessite l'expression des protéines testées dans des quantités facilement détectables, ce qui est mieux réalisée par transformation transitoire de grands nom…

Representative Results

Figure 1, adapté de Zaltsman et al. 17, illustre expériences représentatives pour la détection de la dégradation par le protéasome dans un système acellulaire. Plus précisément, nous démontrons la déstabilisation d'une usine liées à la défense protéine VIP1 par VBF protéine F-box par la voie SCF VBF en N. benthamiana. Arabidopsis VBF et protéines HA-marqués VIP1 (HA-VIP1) ont été transitoirement co-exprimées, et HA-VIP1 la teneur …

Discussion

Ce test repose sur l'expression des protéines testées dans les tissus végétaux, ainsi, le processus potentiel de dégradation par le protéasome se produit évidemment déjà à l'intérieur des tissus vivants. Nous dosage protéine déstabilisation, cependant, que dans les extraits, avec le temps zéro échantillon servant de point de référence initial. Par conséquent, nous définissons comme un essai acellulaire.

Un aspect important pour la réussite de cet essai est le choi…

Materials

Protein assay kit	Bio-Rad	500-0001
Proteinase inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Protean system	Bio-Rad	165-8000
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system	Bio-Rad	170-3940
Affinity Purified Rabbit Anti-Ha	icllab	RHGT-45A-Z
Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane	Pall Corportation	27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacystin	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate	Pierce	35055