מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים
Summary
פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.
Abstract
מסלול היוביקוויטין-proteasome לפירוק חלבונים התפתחה כאחד מהמנגנונים החשובים ביותר לרגולציה של קשת רחבה של תפקודים תאיים כמעט בכל יצורי אוקריוטים. באופן ספציפי, בצמחים, במערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS) מסדירה פירוק חלבונים ותורמת באופן משמעותי לפיתוח של מגוון רחב של תהליכים, כולל תגובה חיסונית, פיתוח ומוות תאים מתוכנת. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שהגדלת פתוגנים רבים צמח, כגון Agrobacterium, לנצל את UPS המארח לזיהום יעיל, תוך שימת דגש על החשיבות של UPS באינטראקציות הצמח לפתוגן.
הספציפיות המצע של UPS מושגת על ידי האנזים יוביקוויטין E3 שפועל בתיאום עם E1 ו-E2 ligases לזהות ולסמן את מולקולות חלבון ספציפיות המיועדות לפירוק על ידי הצמדת אליהם שרשרות של מולקולות יוביקוויטין. סוג אחד של ligases E3 הוא SCF (Skp1 / Cחלבון מורכב Ullin / F-box), שדווקא מכיר במצעי UPS ומטרותיהם לubiquitination באמצעות מרכיב חלבון ה-F-התיבה שלו. כדי לחקור את התפקיד פוטנציאלי של UPS בתהליך ביולוגי של עניין, חשוב לתכנן assay פשוט ואמין לפירוק חלבונים בתיווך UPS. כאן, אנו מתארים assay אחד כזה באמצעות מערכת ללא תא צמח. assay זה יכול להיות מותאם למחקרים של התפקידים של פירוק חלבונים מווסת בתהליכים תאיים שונים, עם דגש מיוחד על אינטראקציות חלבון מצע F-box.
Introduction
המסלול הפרוטאזום ubiquitin/26S מתגלה כמנגנון נפוץ לבקרה של תגובות ביולוגיות שונות, כוללים תקנת תעתיק, התקדמות מחזור התא והולכים אותות, קולט למטה תקנה או אנדוציטוזה, בין השאר מעבד 1-4. במסלול זה, חלבון המטרה מתויג על ידי יוביקוויטין שאריות אשר מחוברות ראשונה באמצעות אג"ח thiolester לאנזים שמפעיל את היוביקוויטין E1 ולאחר מכן translocated לשאריות חומצת אמינו ציסטאין של אנזים היוביקוויטין-נטיית E2, סוף סוף, E2 אינטראקציה עם האנזים E3 יוביקוויטין , וכתוצאה מכך polyubiquitination של מצע החלבון. סופו של דבר, חלבוני polyubiquitinated מוכרים ומושפלים על ידי הפרוטאזום 26S. במנגנון זה, אנזים E3 מציין את המצע ומשמש כמרכיב הרגולציה המרכזי של מערכת ubiquitin/26S הפרוטאזום (UPS). ligases E3 יכול לפעול באופן עצמאי, כגון ligases תחום RING, או כחלק מSCF multisubunit (Sמורכב kp1/Cullin/F-box חלבון), כגון ligases תחום ה-F-התיבה. מסלולי השפלה proteasomal תיווך SCF מעורבים ברגולציה של שעתוק, מחזור תא, העברת אותות 5-10 ופונקציות רבות הסלולר גדולים אחרות.
חוץ מתפקידים אלה קריטיים בויסות תהליכים תאיים, UPS לוקח את הבמה המרכזית ביחסי גומלין הצמח לפתוגן רבים. לדוגמא, ראיות מצביעות על כך שהגדלת מספר פתוגנים צמח, כוללים tumefaciens Agrobacterium, מסתמכים על UPS המארח לכדי להקל על תהליך ההדבקה 11. Agrobacterium מעורר גידולי neoplastic על צמחים, המייצגים את המארחים הטבעיים שלה, וזה גם יכול להפוך מגוון רחב של אאוקריוטים אחרים, מפטריות 1,2 לתאים אנושיים 12,13. במהלך ההדבקה שלו, Agrobacterium מייצא אלמנט ה-DNA (T-DNA) וכמה ארסיות חלבונים (Vir) לתוך התא המארח 12-13. אחד מהחלבונים האלה הוא VirF, חלבון ה-F-התיבה הראשונה שנמצאכדי להיות מקודד על ידי הגנום פרוקריוטים 14. כחלק ממכלול SCF ubiquitin האנזים, VirF, וhomolog המארח הפונקציונלי שלה 15 VBF, להקל על זיהום Agrobacterium באמצעות פירוק חלבונים בתיווך UPS, אשר ככל הנראה מאפשר uncoating של T-DNA חיידקים הפולש מחלבונים החיידקים ומארח הנלווים לה, VirE2 וVIP1, בהתאמה 16,17. מעניין לציין, כי חלבוני ה-F-תיבה רבות, כולל VirF, הם מיסודם לא יציבים בשל proteolysis שלהם, שמתווך על ידי פעילות autoubiquitination 18,19 או על ידי ligases E3 אחר שחלבוני ה-F-תיבה עשויים לשמש כמצעי 20-23.
כאשר לומדים את פעילות הביוכימית של חלבוני ה-F-תיבה, ligases היוביקוויטין אחר, ו / או מצעים שלהם, זה יהיה מאוד שימושי כדי להעסיק assay פשוט ואמין לשפלת proteasomal. כאן אנו מתארים פרוטוקול אחד כזה לניתוח יציבות חלבון בתאללא מערכת. ב assay זה, היציבות של מצע UPS הוא ניתח בנוכחותו או היעדריו של אחד מהמרכיבים החיוניים של מסלול proteasomal השפלה, כגון חלבון ה-F-תיבה, במערכת ללא תא. באופן כללי, אנו מביעים את החלבון (ים) שנבדק ברקמות צמח, להכין תמציות תא ללא מרקמות אלה ולפקח על הכמויות של החלבון (ים) של עניין על ידי מערבי סופג. מנגנון UPS תלוי של פירוק חלבונים מודגם על ידי הכללתם של מעכבי proteasomal ספציפיים ו / או שימוש coexpression של צורה דומיננטית שלילית של מרכיב SCF, Cullin. הואיל ואנו להמחיש assay זה באמצעות השפלה proteasomal של חלבון ארבידופסיס VIP1 17 על ידי חלבון ה-F-תיבת 15 VBF, זה עשוי להיות מועסק על מנת לחקור את היציבות של כל מצעי proteasomal אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
assay זה מסתמך על הביטוי של החלבונים שנבדקו ברקמות צמח, ולכן תהליך התדרדרות proteasomal הפוטנציאל ברור שמתרחש כבר בתוך רקמות החיות. אנו assay יציבות חלבון, לעומת זאת, רק בתמציות, בזמן אפס מדגם המשמש כנקודת התייחסות הראשונית. לפיכך, אנו מגדירים אותו כassay ללא תא.
<p class="jove_content" style=…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה שהובילה לפרסום זה קיבלה מימון מתכנית מארי קירי COFUND "U-הניידות", cofinanced על ידי האוניברסיטה של מלאגה ותכנית האיחוד האירופי 7 מסגרת ה (FP7/2007-2013) תחת GA מס 246,550. העבודה במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי מענקים מ-NIH, משרד החקלאות / NIFA, NSF, בארד, וBSF לVC
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
