Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas
Summary
Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de "tags", como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal.
Abstract
A via da ubiquitina-proteassoma por degradação proteica tem emergido como um dos mecanismos mais importantes para a regulação de uma grande variedade de funções celulares em praticamente todos os organismos eucarióticos. Especificamente, em plantas, o sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS) regula a degradação de proteína e contribui significativamente para o desenvolvimento de uma ampla variedade de processos, incluindo a resposta imunológica, desenvolvimento e morte celular programada. Além disso, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, tais como Agrobacterium, explorar as UPS de acolhimento para a infecção eficiente, enfatizando a importância da UPS em interações planta-patógeno.
A especificidade do substrato da UPS é conseguido pela ubiquitina-ligase E3, que actua em conjunto com a E1 e E2-ligases para reconhecer e marcar as moléculas de proteína específicos destinados a degradação, anexando-os a cadeias de moléculas de ubiquitina. Uma classe das ligases E3 é o SCF (Skp1 / Cproteína Ullin / F-box) complexo, que reconhece especificamente os substratos UPS e tem como alvo os para ubiquitination através do seu componente de proteína F-box. Para investigar um papel potencial da UPS em um processo biológico de interesse, é importante elaborar um ensaio simples e confiável para a degradação de proteínas mediada por UPS. Aqui, nós descrevemos um tal teste, utilizando um sistema isento de célula de planta. Este ensaio pode ser adaptado para estudos sobre os papéis de degradação da proteína regulada em diversos processos celulares, com um foco especial sobre as interações proteína-substrato da caixa-F.
Introduction
A via proteassoma ubiquitin/26S está emergindo como um mecanismo generalizado para o controle de diversas reações biológicas, incluindo a regulação da transcrição, a progressão do ciclo celular e transdução de sinal, receptor infra-regulação ou endocitose, entre outros processos 1-4. Nesta via, a proteína alvo é identificado pela ubiquitina resíduos que estão ligados através de uma primeira ligação thiolester a enzima activadora de ubiquitina E1 e translocados para um resíduo de aminoácido cisteína da enzima de conjugação da ubiquitina-E2 e, finalmente, E2 interage com ubiquitina ligase E3 , resultando em polyubiquitination do substrato de proteína. Em última análise, as proteínas polyubiquitinated são reconhecidos e degradado pelo proteassoma 26S. Neste mecanismo, a enzima E3 especifica o substrato e funciona como o componente regulador chave do sistema de proteassoma ubiquitin/26S (UPS). Ligases E3 pode agir de forma independente, como ligases domínio RING, ou como parte de um SCF multisubunit (Sproteínas) complexo kp1/Cullin/F-box, tais como ligases de domínio F-box. SCF mediadas por vias de degradação proteosomal estão envolvidas na regulação da transcrição, do ciclo celular, a transdução de sinal 5-10 e muitas outras importantes funções celulares.
Além desses papéis críticos na regulação de processos celulares, UPS toma o palco central em muitas interações planta-patógeno. Por exemplo, a evidência crescente sugere que vários patógenos de plantas, incluindo Agrobacterium, contam com a UPS host para facilitar o processo de infecção 11. Agrobacterium provoca tumores neoplásicos em plantas, os quais representam os seus hospedeiros naturais, e também podem transformar uma vasta gama de outros eucariotas, a partir de fungos de 1,2 para as células humanas 12,13. Durante a infecção, Agrobacterium exporta um elemento de DNA (T-DNA) e várias proteínas de virulência (vir) na célula hospedeira 12-13. Uma dessas proteínas é VirF, a primeira proteína F-box encontradoa ser codificada por um genoma procariótico 14. Como parte do complexo de SCF ubiquitina-ligase, VirF, e seu homólogo funcional hospedeiro VBF 15, facilitar a infecção por Agrobacterium por meio da degradação de proteínas mediado por UPS, que presumivelmente facilita desencapsulamento de o T-DNA de bactérias invasoras dos seus acompanhantes e proteínas bacterianas hospedeiras, VirE2 e VIP1, respectivamente 16,17. Curiosamente, muitas proteínas F-box, incluindo VirF, são intrinsecamente instáveis devido ao seu próprio proteólise, que é mediada pela actividade autoubiquitination 18,19 ou por outras ligases E3 para o qual as proteínas F-box podem servir como substratos 20-23.
Ao estudar actividades bioquímicas das proteínas F-box, outros ubiquitina ligases, e / ou os seus substratos, seria muito útil para empregar um ensaio simples e fiável para a degradação do proteossoma. Descrevemos aqui um tal protocolo para a análise da estabilidade da proteína na célula-Livre do sistema. Neste ensaio, a estabilidade do substrato UPS é analisada na presença ou ausência de um dos componentes essenciais da via de degradação do proteossoma, tal como uma proteína da caixa F, num sistema isento de células. Em geral, a expressão da proteína testada (s) em tecidos de plantas, preparação de extractos de células livres a partir destes tecidos e controlar as quantidades de proteína (s) de interesse por western blotting. O mecanismo dependente da UPS de degradação de proteínas é demonstrada pela inclusão de inibidores de proteossomo específicas e / ou da utilização de co-expressão de forma dominante negativa de um componente de SCF, Cullin. Considerando que ilustram este ensaio utilizando degradação proteosomal da proteína de Arabidopsis VIP1 17 pela proteína F-VBF caixa 15, que pode ser empregue para investigar a estabilidade de quaisquer outros substratos proteossomo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensaio baseia-se na expressão das proteínas testadas em tecidos de plantas, assim, o processo de degradação potencial proteosomal obviamente, já ocorre dentro dos tecidos vivos. Nós ensaio desestabilização da proteína, no entanto, apenas nos extratos, com o tempo de amostra de zero servindo como ponto de referência inicial. Por isso, nós definimos como um ensaio isento de células.
Um aspecto importante para o sucesso deste ensaio é a escolha correcta do vector de expressão…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os trabalhos que conduziram a esta publicação tem recebido financiamento do programa Marie Curie COFUND "U-Mobility", co-financiado pela Universidade de Málaga e do Programa da União Europeia 7 º Programa-Quadro (FP7/2007-2013) sob n º 246550 GA. O trabalho em nosso laboratório é suportado por concessões do NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, e BSF para VC
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
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