Опробование протеасомной деградации в бесклеточной системе у растений
Summary
Целевые деградации белков представляет собой важный механизм регулирования в отношении функции клеток. Это происходит с помощью консервативной убиквитин-протеасом пути, который придает полиубиквитиновый цепи с белком-мишенью, что тогда служить "теги", как молекулярные для 26S протеасомы. Здесь мы описываем простой и надежный бесклеточный анализ для протеасомной деградации белков.
Abstract
Убиквитин-протеасомный путь для деградации белка стала одним из наиболее важных механизмов регулирования широкого спектра клеточных функций практически во всех эукариотических организмов. В частности, в растениях, протеасом система ubiquitin/26S (UPS) регулирует деградацию белков и вносит значительный вклад в развитие широкого диапазона процессов, в том числе иммунного ответа, развития и запрограммированной гибели клеток. Кроме того, все больше доказательств о том, что многочисленные возбудители растений, такие как Agrobacterium, эксплуатировать узлов ИБП для эффективного инфекции, подчеркивая важность ИБП в завод-патогенных взаимодействий.
Субстратной специфичности UPS достигается убиквитин-лигазы Е3, который действует согласованно с E1 и E2 лигазы признать и отметить специфические белковые молекулы, предназначенные для деградации путем присоединения к ним цепей молекул убиквитина. Один класс Е3 лигазы является SCF (Skp1 / CUllin / F-коробка белок) комплекс, который специфически распознает подложек ИБП и цели их для убиквитинирования через его компонента F-коробка белка. Чтобы исследовать потенциальную роль UPS в биологическом процессе интерес, важно разработать простой и надежный анализ для UPS-опосредованной деградации белков. Здесь мы описываем один такой анализ с помощью мобильного без системы растений. Этот анализ может быть адаптирована для изучения роли регулируемой деградации белков в различных клеточных процессов, с особым упором на F-коробка белок-субстрат взаимодействий.
Introduction
Ubiquitin/26S протеасомный путь становится широко распространенной механизма контроля разнообразных биологических реакций, в том числе регуляции транскрипции, прогрессии клеточного цикла и передачи сигнала, рецептор понижающей регуляции или эндоцитоза, среди других обрабатывает 1-4. В этом пути, целевой белок помечены убиквитин остатки, которые сначала присоединен через тиолэфирной связью с убиквитин-активирующий фермент Е1 и затем перемещаться до остатка аминокислоты цистеина убиквитин-сопряжение фермента Е2 и, наконец, E2 взаимодействует с убиквитин лигазы Е3 , в результате чего polyubiquitination белкового субстрата. В конечном счете, polyubiquitinated белки распознаются и разрушается в результате 26S протеасомы. В этом механизме, фермент Е3 задает подложку и действует в качестве ключевого компонента регулирующего протеасомы системы ubiquitin/26S (UPS). E3 лигазы может действовать независимо, такие, как лигазы доменных кольцо или как часть мультисубъединичных SCF (Skp1/Cullin/F-box белок) комплекс, например, лигаз доменных F-коробки. SCF-опосредованные пути протеасомной деградации участвуют в регуляции транскрипции, клеточного цикла, передаче сигналов 5-10 и многих других крупных клеточных функций.
Помимо этих важнейших ролей в регуляции клеточных процессов, UPS занимает центральное место в многих растений патогенных взаимодействий. Например, увеличение данные свидетельствуют о том, что несколько патогены растений, в том числе Agrobacterium tumefaciens, полагаться на хозяина ИБП для для облегчения процесса инфекции 11. Agrobacterium вызывает опухолевые наросты на растениях, которые представляют для естественных хозяев, и это также может преобразовывать широкий спектр других эукариот, от грибов 1,2 с клетками человека 12,13. За время своего инфекции, Agrobacterium экспортирует элемент ДНК (Т-ДНК) и несколько вирулентность (Vir белков) в клетку-хозяина 12-13. Один из этих белков VirF, первый белок F-коробка найденокоторый должен быть закодирован прокариотической генома 14. В рамках убиквитинлигазы комплекса SCF, VirF и его функциональной принимающей гомолога ВПЗ 15, облегчения Agrobacterium инфицирование через UPS-опосредованной деградации белков, которые, предположительно, облегчает декапсидацию вторжения бактерий Т-ДНК из его сопровождающих бактериальных и белков хозяина, VirE2 и VIP1 соответственно 16,17. Интересно, что многие белки F-коробка, в том числе VirF, по своей природе нестабильны из-за их собственной протеолиза, который, опосредованного активностью autoubiquitination 18,19 или другими E3 лигазы, для которого F-коробка белки могут служить субстратами 20-23.
При изучении биохимических деятельности F-коробка белков, других убиквитиновых лигаз, и / или их субстратов, было бы очень полезно использовать простой и надежный тест для протеасомной деградации. Здесь мы опишем один такой протокол для анализа стабильности белка в клетке-Свободная система. В этом анализе, стабильность подложки UPS анализируют в присутствии или в отсутствие одного из важнейших компонентов в пути деградации протеосомной, такой как белок F-бокса, в бесклеточной системе. Как правило, мы выразить испытаны белок (белки) в тканях растений, готовят бесклеточных экстрактов из этих тканей, и контролировать количество белка (ов), представляющие интерес помощью вестерн-блоттинга. Механизм ИБП зависит от деградации белков свидетельствует включения специфических ингибиторов протеасом и / или с использованием коэкспрессия доминантно-негативной форме SCF компонента, Каллин. В то время как мы иллюстрации этого анализа с использованием протеасомной деградации в Arabidopsis VIP1 17 белка белка F-бокса ВПЗ 15, он может быть использован для исследования устойчивости любых других протеасом субстратов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот анализ основан на экспрессии исследуемых белков в тканях растений, таким образом, потенциал процесс деградации протеасомы, очевидно, происходит уже в живые ткани. Мы анализе белка дестабилизации, однако, только в экстрактах, со временем нулевой образец, выступающей в качестве нач?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа приводит к этой публикации получил финансирование из программы Мари Кюри COFUND "U-Mobility", совместно финансируемый университета Малага и Евросоюз 7-й Рамочной программы (FP7/2007-2013) под GA-№ 246550. Работа в нашей лаборатории поддержана грантами NIH, USDA / NIFA, NSF, бард, и ЧФ в ВК
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
