Analys proteasomal Nedbrytning i ett cellfritt system i växter
Summary
Riktade nedbrytning protein utgör en viktig reglerande mekanism för cellernas funktion. Det sker via en konserverad ubiquitin-proteasom väg, som fäster polyubiquitin kedjor till målproteinet som sedan fungerar som molekylära "taggar" för 26S proteasom. Här beskriver vi en enkel och tillförlitlig cellfri analys för proteasomal nedbrytning av proteiner.
Abstract
Ubiquitin-proteasom väg för proteinnedbrytning har seglat upp som en av de viktigaste mekanismerna för reglering av ett brett spektrum av cellulära funktioner i praktiskt taget alla eukaryota organismer. Närmare bestämt i växter, det ubiquitin/26S proteasomsystemet (UPS) reglerar proteinnedbrytning och bidrar i hög grad till utvecklingen av ett brett spektrum av processer, inklusive immunsvar, utveckling och programmerad celldöd. Dessutom tyder allt fler bevis för att många växtpatogener, såsom Agrobacterium, utnyttja värd UPS för effektiv infektion, betonar vikten av UPS i växt-patogen interaktioner.
Substratspecificiteten för UPS uppnås genom E3 ubiquitin ligas som agerar i samförstånd med E1 och E2 ligaser att känna igen och markera specifika proteinmolekyler avsedda för nedbrytning genom att binda till dessa kedjor av ubiquitin-molekyler. En klass av E3 ligaser är SCF (Skp1 / CUllin / F-box protein) komplex, som specifikt känner igen UPS substrat och riktar dem för ubiquitinationen via sin F-låda proteinkomponent. För att undersöka en potentiell roll för UPS i en biologisk process av intresse, är det viktigt att utforma en enkel och tillförlitlig analys för UPS-medierad nedbrytning protein. Här beskriver vi en sådan analys med användning av ett växtcellfritt system. Denna analys kan anpassas för studier av roller reglerade proteinnedbrytningen i olika cellulära processer, med särskilt fokus på F-box protein-substrat interaktioner.
Introduction
Den ubiquitin/26S proteasome vägen framstår som en omfattande mekanism för reglering av olika biologiska reaktioner, inklusive transkriptionsreglering, cell-cykelprogression och signaltransduktion, receptor nedreglering eller endocytos, bland andra processer 1-4. I denna väg, är målproteinet taggats av ubiquitin rester som först är anslutna via en tiolester bindning till ubikvitin-aktiverande enzym E1 och sedan förflyttade till en cystein-aminosyrarest av ubikitin-konjugering enzym E2, slutligen, E2 samverkar med ubikvitin-ligas E3 , vilket resulterar i polyubiquitinering av proteinsubstrat. I slutändan är de polyubiquitinerade proteinerna erkända och ned av 26S proteasom. I denna mekanism, specificerar E3-enzymet underlaget och fungerar som den viktigaste reglerande komponenten i ubiquitin/26S proteasomsystemet (UPS). E3-ligaser kan agera självständigt, såsom RING domain ligaser, eller som del av en multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) komplex, till exempel F-låda domän ligaser. SCF-medierade proteasomal nedbrytningsvägar är involverade i regleringen av transkription, cellcykeln, signaltransduktion 5-10 och många andra viktiga cellulära funktioner.
Förutom dessa kritiska roller i regleringen av cellulära processer, tar UPS den centrala scenen i många växt-patogen interaktioner. Exempelvis tyder allt fler bevis för att flera växtpatogener, bland Agrobacterium tumefaciens, förlitar sig på värd UPS för att underlätta infektionsprocessen 11. Agrobacterium framkallar neoplastiska utväxter på växter, som representerar sina naturliga värdar, och det kan också omvandla en rad andra eukaryoter, från svampar 1,2 till mänskliga celler 12,13. Under dess infektion, exporterar Agrobacterium ett DNA-element (T-DNA) och flera virulens (Vir) proteiner in i värdcellen 12 till 13. Ett av dessa proteiner är VirF den första F-box-protein som finnssom skall kodas med en prokaryot genomet 14. Som en del av SCF ubiquitin ligas komplex, VirF, och dess funktionella värd homolog VBF 15, lätta Agrobacterium infektion via UPS-medierade proteinnedbrytning, vilket förmodligen underlättar uncoating av invaderande bakterie T-DNA från dess medföljande bakteriella och värdproteiner, VirE2 och VIP1, respektive 16,17. Intressant nog många F-låda proteiner, inklusive VirF, är i sig instabil på grund av sin egen proteolys, som medieras av autoubiquitination aktivitet 18,19 eller genom andra E3-ligaser för vilka F-box-proteiner kan tjäna som substrat 20-23.
När man studerar biokemiska aktiviteter F-box proteiner, andra ubiquitin ligas, och / eller deras substrat, skulle det vara mycket användbart att använda en enkel och tillförlitlig analys för proteasomal nedbrytning. Här beskriver vi ett sådant protokoll för analys av proteinstabilitet i en cellFritt system. I denna analys är stabiliteten i UPS-substrat analyseras i närvaro eller frånvaro av en av de viktigaste komponenterna i proteasomal nedbrytningsvägen, till exempel en F-låda protein, i ett cellfritt system. Generellt vi uttrycka den testade protein (er) i växtvävnader, framställa cellfria extrakt från dessa vävnader och övervaka de mängder av protein (er) av intresse genom western blotting. UPS-beroende mekanism av protein nedbrytning kan påvisas genom införande av specifika proteasomal hämmare och / eller med hjälp av samuttryck av dominant-negativ form av en SCF-komponent, Cullin. Medan vi illustrera denna analys med användning av proteasomal nedbrytning av Arabidopsis VIP1 17 protein genom F-box-protein VBF 15 kan det användas för att undersöka stabiliteten hos några andra proteasomal substrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna analys är beroende av uttrycket av de testade proteinerna i växtvävnader, och därför förekommer det potentiella processen proteasomal nedbrytning naturligtvis redan inom de levande vävnaderna. Vi analys protein destabilisering, dock endast i extrakten, med tiden noll prov fungerar som den ursprungliga referenspunkten. Därför definierar vi den som en cellfri analys.
En viktig aspekt för framgång för denna analys är det korrekta valet av expressionsvektor från vilken den te…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det arbete som lett fram till denna publikation har erhållit finansiering från Marie Curie COFUND programmet "U-Mobility", som medfinansieras av universitetet i Malaga och Europeiska unionens 7: e ramprogram (FP7/2007-2013) under GA nr 246550. Arbetet i vårt laboratorium stöds av anslag från NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, och BSF till VC
Materials
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Affinity Purified Rabbit Anti-Ha | icllab | RHGT-45A-Z | |
| Goat anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corportation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| Lactacystin | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate | Pierce | 35055 |
References
- Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
- Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
- Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
- Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
- Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
- Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
- Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
- Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
- Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
- Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
- Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
- Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
- Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
- Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
- Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
- Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
- Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
- Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
- Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
- Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
- Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
- Ausobel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).
