Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires
Summary
Progénitrices neurales mitose est un paramètre critique de la neurogenèse. Une grande partie de notre compréhension des neurones progéniteurs mitose est basé sur l'analyse des tissus fixés. Imagerie en temps réel dans des tranches de cerveau embryonnaire est une technique souple pour évaluer la mitose avec une résolution temporelle et spatiale dans un environnement contrôlé.
Abstract
Bien que de courte durée, la mitose est un processus multi-étapes complexe et dynamique fondamentale pour le développement des organes, y compris le cerveau. Dans le cortex cérébral en développement, la mitose anormale de cellules progénitrices neurales peut causer des malformations à la taille et la fonction du cerveau. Par conséquent, il existe un besoin critique des outils pour comprendre les mécanismes de neurones progéniteurs mitose. Développement cortical chez les rongeurs est un modèle exceptionnel pour l'étude de ce processus. Progénitrices neurales mitose est souvent examiné dans les sections du cerveau fixes. Ce protocole décrit en détail une approche de l'imagerie en direct de la mitose en ex vivo des tranches de cerveau embryonnaires. Nous allons décrire les étapes essentielles de cette procédure, qui comprennent: l'extraction du cerveau, intégration, vibratome découpe des tranches de cerveau, la coloration et la culture de tranches, et imagerie time-lapse. Nous allons ensuite montrer et décrire en détail comment effectuer une analyse post-acquisition de la mitose. Nous incluons résultats représentatifs from ce dosage en utilisant le colorant vital Syto11, des souris transgéniques (histone H2B-EGFP et centrine-EGFP), et l'électroporation in utero (mCherry-α-tubuline). Nous allons discuter de la façon dont cette procédure peut être mieux optimisé et comment il peut être modifié pour l'étude de la régulation génétique de la mitose. Imagerie en temps réel de la mitose dans des tranches de cerveau est une approche souple pour évaluer l'impact de l'âge, de l'anatomie, et la perturbation génétique dans un environnement contrôlé, et de générer une grande quantité de données avec une résolution spatiale et temporelle. Ainsi ce protocole vient compléter les outils existants pour l'analyse des neurones progéniteurs mitose.
Introduction
L'objectif global de ce protocole est de décrire comment effectuer l'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans des tranches de cerveau embryonnaires. En utilisant l'imagerie en direct de tranches de cerveau de la culture, ce protocole fournit une méthode simple pour analyser les multiples aspects de la mitose dans les progéniteurs neuronaux dans un environnement très similaire à un cadre in vivo. Il peut être appliqué sur le cerveau des animaux et / ou les cerveaux mutantes qui ont été manipulés par électroporation in utero) 5.1. Cette technique est également idéal pour tester l'effet d'agents pharmacologiques sur la mitose de précurseurs neuronaux, par le simple ajout d'un agent pour le milieu de culture. En somme, cet article va faire un protocole défi technique accessible à ceux qui étudient la neurogenèse.
Au cours de la neurogenèse, les populations progénitrices neurales distinctes subissent divisions précises pour générer des neurones qui contribuent finalement à six couches corticales de l'adulte néocortex 6-8. Au début du développement cortical, la piscine de précurseur neural se développe comme neuroépithéliales (NE) les cellules se divisent de manière symétrique à se renouveler. cellules NE transforment en cellules gliales radiales (CGR). Initialement CGR divisent symétriquement à produire deux nouveaux CGR, mais pendant la plus grande partie de la neurogenèse, principal mode de CGR de division est asymétrique. Dans la division asymétrique, une RGC donne lieu à un nouveau RGC et soit un neurone post-mitotique, ou un progéniteur plus spécialisé (soit un précurseur neuronal court (SNP), une glie radiale externe (ORG), ou un progéniteur intermédiaire (INP) 2,3,7,9. INP, SNP, et ORG peuvent alors générer des neurones à la sous-ventriculaire, ventriculaire, et les régions du cortex basaux, respectivement. conséquent, la division cellulaire des progéniteurs est un processus fondamental pour générer des neurones de l' néocortex.
De nombreuses études font état d'une corrélation entre les traits spécifiques de la mitose CGR et le destin des cellules filles. Haydar et al. Et Takahashi et al.ont montré que RGC durée mitotique et augmentation de la longueur du cycle cellulaire comme neurogenèse produit, une constatation fait écho dans le suivi des études 10-13. Un certain nombre d'études ont suggéré que fuseau mitotique orientation par rapport au ventricule influe sur les aspects de la neurogenèse et corticogenèse, y compris les types de neurones générés et le placement de la descendance dans le cerveau, respectivement 3,10,14-16. Que plan de clivage orientation influe directement sur le destin des cellules est controversée, mais la conclusion reste que cette mitotique impacts de paramètres neurogenèse. Souligne en outre l'importance de la mitose est l'observation que de nombreux gènes impliqués dans les mécanismes de la mitose sont cruciales pour la neurogenèse et de bon développement du cerveau 17-20.
La mitose est un processus dynamique, encore à ce jour la plupart des études détaillant progénitrices neurales mitose utiliser l'analyse des coupes de tissus fixes ou imagerie de progéniteurs neuronaux via la culture de cellules in vitro. Ainsi, les procédés traditionnels pour évaluer la mitose ne fournissent qu'un aperçu de ce processus et ne parviennent pas à découvrir comment les cellules se comportent dans un tissu. L'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose est progressivement devenu un outil essentiel pour comprendre la fonction neuronale progénitrice. Pour des exemples s'il vous plaît voir ces références 4,8,10,21-25. Plusieurs protocoles en circulation ont été publiées pour la préparation et l'imagerie des tranches de cerveau 26,27. Toutefois à ce jour, un protocole détaillé pour l'imagerie et l'analyse de la mitose n'a pas été décrite ni démontré dans la vidéo.
Cette technique offre plusieurs avantages importants par rapport à l'analyse fixe de coupes de cerveau. Analyse Time-lapse de tranches de cerveau permet la génération de beaucoup plus de points de données qui peuvent être analysées de manière flexible. Tout d'abord, les données sont collectées à des instants individuels sur une période de plusieurs minutes ou plusieurs heures. On peut analyser des points de temps individuels (pour créer un montage statique) oupeut combiner différents moments dans les films. Deuxièmement, l'imagerie confocale de tranches permet la génération de données au niveau des sections de Z différents dans des tranches de cerveau. En conséquence, les sections individuelles peuvent être analysées. En variante, des piles de sections individuelles peuvent être combinées en une projection d'intensité maximale. Troisièmement, l'analyse se fait dans le cadre d'un tissu, révélant comment les cellules se divisent par rapport à des cellules et des structures voisines. Quatrièmement, il est parfaitement adapté à l'analyse de mutants qui montrent des signes de défauts mitotiques. Ensemble, ce protocole permettra de clarifier les étapes critiques pour aider les chercheurs qui souhaitent faire de l'imagerie en direct de neurones progéniteurs mitose dans leurs propres laboratoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'avantage majeur du protocole que nous avons décrit est qu'il fournit une résolution temporelle dynamique de la mitose de cellules progénitrices neurales. Typiquement, les dosages de visualiser la mitose dans le cerveau en développement sont effectuées par immunofluorescence de coupes de tissus fixés. Mais cette approche ne donne qu'un aperçu de la mitose à un point de temps.
Il existe plusieurs étapes qui sont les plus critiques pour l'imagerie de la mitose dans de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent financement du NINDS / NIH, R00-NS064197 et NINDS / NIH, R01NS083897 (à la fois pour DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
- Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
- Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
- LoTurco, J. J., Manent, J. -. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
- Wang, X., Tsai, J. -. W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
- Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Pilaz, L. -. J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
- Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
- Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
- Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
- Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
- Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
- Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
- Hu, D. J. -. K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
- Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
- Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
- Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
- Hadjantonakis, A. -. K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
- Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Yang, Y. -. T., Wang, C. -. L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
- Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).
