血液白细胞和血小板可以作为一个单独的整体生物能量健康的一个标志,所以具有监视病理过程和治疗的影响的可能性。这里我们描述的方法来分离并测量线粒体功能和在这些细胞中的氧化爆发。
线粒体功能障碍是已知在许多病理情况,如动脉粥样硬化,糖尿病,脓毒性休克,以及神经变性疾病,但评估的变化在患者生物能量函数是具有挑战性的方面发挥显著作用。虽然疾病如糖尿病或动脉粥样硬化现在临床上使用的特定器官损伤,病理学的全身性成分,如高血糖症或炎症,可在循环中的白细胞或血小板改变生物能量函数。这个概念已经认识了一段时间,但它的广泛应用受到限制由大量需要的生物能分析原代细胞。本技术限制已经克服相结合的磁珠分离技术,细胞黏附技术,它允许贴壁细胞不活化微孔板的特殊性,以及新技术的敏感性专为高吞吐量的麦克风roplate期呼吸。这种设备的一个例子是胞外通量分析仪。这样的仪器通常使用氧和pH敏感的探针来测量变化在贴壁细胞这些参数的速率,然后可以与新陈代谢。在这里,我们详细方法的单核细胞,淋巴细胞,嗜中性粒细胞和血小板的分离和电镀,而不活化,从人血液和在这些细胞中的线粒体生物能量函数的分析。此外,我们展示了如何突发在单核细胞和嗜中性粒细胞的氧化还可以在同一样品中进行测定。因为这些方法只使用8-20毫升人类血液它们有潜力用于监测在临床环境中的活性氧的生成和生物能。
监测免疫细胞(单核细胞,淋巴细胞,嗜中性粒细胞)和从血小板的生物能量健康已经认识了一段时间作为一个潜在的有用的诊断工具,以评估一个个体的整体健康的生物能量。有文献的一种新兴体归于多种疾病,如癌症,心血管疾病和神经变性疾病线粒体功能障碍1,2。这在临床上是重要的,因为线粒体功能障碍可以发起一系列促进促炎症信号传导途径,或导致细胞死亡的细胞事件。一些研究已经特征外周血单核细胞和血小板中,如纤维肌痛,糖尿病,脓毒性休克,和阿尔茨海默氏病3-7条件的线粒体功能。例如,最近的一项研究评估血小板的生物能作为标记线粒体功能和发现,2型diabet血小板IC患者已经减少线粒体氧耗7,8。从这些结果和其他人,很显然,单核细胞,淋巴细胞,嗜中性粒细胞和血小板,因为他们的调查系统循环,并可以反映局部和全局的代谢变化可以作为病理条件下的变化的生物能作为替代标志物。为了确定这种做法是否具有预测或诊断价值分析的高通量方法和所需的细胞制备的一致方法。
衡量白细胞和血小板线粒体功能的方法以前参与细胞的线粒体生物能学或评估的隔离完整细胞4,9。使用的细胞外磁通(XF)分析器细胞生物能评估的优点是,在细胞中的线粒体功能,可与内源性底物和呼吸参数如质子泄漏和最大呼吸建立容量可以被确定。我们和其他人已经使用此技术来显示,血小板生物能访问,单核细胞和淋巴细胞从人血液中分离可以建立和中间细胞类型8相比较。此外,这两种嗜中性粒细胞和单核细胞具有一氧化猝发能力,其中NAPDH氧化酶被激活并消耗氧以形成过氧化物。重要的是,这一途径是先天免疫的重要组成部分,是由全身性炎症调制。例如,已经表明,改变氧化猝发能力与各种自身免疫性疾病,如多发性硬化症,关节炎和复发性感染10,11相关联。目前没有可用来测量在临床样品中的氧化爆发不高通量定量测定。这是重要的,因为表征嗜中性粒细胞和单核细胞的氧化爆发的能力也可以作为数的病态的一个重要的诊断工具吉斯。
关键的技术挑战已经使用传统极谱技术耗氧量的测量,以及需要使用更灵敏的微量荧光技术时使用的贴壁细胞敏感性低。在这个实际视频中,我们描述的技术解决了这些问题。我们详细介绍了方法的单核细胞,淋巴细胞,嗜中性粒细胞和血小板与氧化猝发的单核细胞和人血液嗜中性粒细胞的生物能量学的分离,电镀和测量,该方法适用于生物能学和氧化猝发的临床评估为有研究者访问一个患者群体和取得新鲜血液样品的能力。
该协议代表了适合生物能学分析的方式几种常用的技巧血细胞分离编译。介绍了连续的技术是有利的,其他的隔离方法( 即 FACS分析),为他们的分离大量的细胞在控制的媒体环境与放置在分离的细胞最小应力的能力。它有漫长的隔离,即使以最小的中断的缺点。这个协议作为基础初级血细胞从人类受试者,其可以外推到临床设置和平移研究的隔离。
MACS分离是可靠的细胞分离技术,提供了直接从全血中分离细胞的可能性,但是,这种方法需要更大量的抗体,而不是最适合作为在该方法中所描述的所有四种不同类型的细胞的分离。那里有BEEN没有证据表明,MACS分离结果在激活的阳性选择的白细胞使用我们的隔离协议。 MACS柱函数通过使用偶联至50nm的超顺磁性粒子的抗体在磁场中的标记的细胞封存。然后标记的细胞被洗脱出来的柱。正面和负面的选择在本协议执行,以确保迅速隔离和纯度。如果不足的细胞数是从分离获得或纯度是有问题,多种抗体可以通过LS柱被加入到样品中作为每个供应商的指令和第二通道,可能导致更高的纯度( 表2)。我们实验室发现的高纯度和电镀效率利用现有的协议通过FACS分析分析8决赛细胞悬液。
胞通量分析仪具有较的加时,以监测氧的消耗和介质酸化实时能力她的电极。氧气消耗在单核细胞和中性粒细胞的氧化爆发响应,观察到的是NADPH氧化酶的影响,具体表现出抑制与DPI 8。我们已经看到在氧化爆发能力与时间相关的损失与长期隔离或延长XF检测。这个协议被设计和开发,以XF24使用,但也与XF96兼容于大约三分之一到二分之一XF24细胞接种密度( 图3)。
在这个协议的设计,坚持为每个技术现有的协议是需要与纯粹来控制媒体条件下生物能分析修改的最佳性能。掌握技术后,这样的协议可以用来在平移和研究应用的各种各样测量的治疗策略的毒性和有效性,探索疾病的代谢特征,和氧化剂的生产由单核细胞和NEUTrophils在炎症条件。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢凯莱一个贝纳维德斯的技术贡献。这项工作是由美国心脏协会13PRE16390001(SR),美国国立卫生研究院T32HL07918(PAK),美国国立卫生研究院T32HL007457(TM),P30DK056336(BKC)的支持,NIDDK糖尿病并发症联盟(DiaComp,www.diacomp.org)授予DK076169(subaward VDU)而奥布莱恩中心P30 DK079337(VDU)。
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |