इस के साथ साथ हम फफोले, प्रतिलेखन और अनुवाद मशीनरी के encapsulation, और प्रोटीन के उत्पादन की निगरानी की तैयारी के लिए सरल विधियों का वर्णन. परिणामस्वरूप सेल मुक्त प्रणालियों जटिल सेलुलर mimics के निर्माण के लिए जिसमें से एक शुरुआती बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
व्यक्तिगत अणुओं से अणुओं की प्रणालियों के लिए ब्याज की पाली के रूप में, प्रयोगशालाओं की संख्या बढ़ बेहतर सेलुलर जीवन की जटिलता का प्रतिनिधित्व करते हैं कि सेलुलर mimics, नीचे से ऊपर का निर्माण करने की मांग की है. पानी में तेल emulsions, microfluidic उपकरणों, और vesicles के शोषण सहित compartmentalized सेलुलर mimics के निर्माण के लिए ले जाया जा सकता है कि रास्तों में से एक नंबर रहे हैं तिथि करने के लिए. उपलब्ध विकल्पों में से प्रत्येक विशिष्ट फायदे और नुकसान है. उदाहरण के लिए, पानी में तेल emulsions उच्च कैप्सूलीकरण दक्षता दे, लेकिन अच्छी तरह से जीवित कोशिकाओं की पारगम्यता बाधा की नकल नहीं है. इस के साथ साथ वर्णित विधि का प्राथमिक लाभ यह है कि वे सभी के लिए आसान और लागू करने के लिए सस्ता हो रहा है. प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी इस तरह के एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण और एक extruder के रूप में आम इंस्ट्रूमेंटेशन, शोषण करने वाली एक प्रक्रिया के माध्यम से फॉस्फोलिपिड vesicles के अंदर समझाया है. प्रतिक्रियाओं प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा निगरानी कर रहे हैं. प्रोटोकॉलएस पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति, सेलुलर mimics के निर्माण, सेलुलर जीवन के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं का अन्वेषण, या आनुवंशिक circuitry के विधानसभा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
सेल मुक्त, इन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिक्रियाओं और सिंथेटिक लिपिड से vesicles की पीढ़ी नई बात नहीं है. हालांकि, नकल एक सेलुलर में दो के संयोजन challenging1 -6 काफी अधिक है. ई. T7 शाही सेना पोलीमरेज़ के साथ या बिना कोलाई सेल अर्क प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी 7,8 के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटीन अभिव्यक्ति और तह सुविधा कर सकते हैं कि अतिरिक्त सेलुलर घटकों की उपस्थिति से सेल अर्क लाभ. वैकल्पिक रूप से, व्यक्तिगत रूप से शुद्ध आरएनए और प्रोटीन के अणुओं का मिश्रण, शुद्ध प्रणाली 9 यानी intravesicular प्रोटीन संश्लेषण 4,10-14 मध्यस्थता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. शुद्ध प्रणाली पूरी तरह से परिभाषित सेलुलर mimics के निर्माण के लिए अनुमति देता है और सेल निष्कर्षों में पाया nuclease गतिविधि से ग्रस्त नहीं है. व्यावहारिक रूप से, यह इस तरह कम कैप्सूलीकरण दक्षता 11 के साथ प्रक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने, बहुत कम डीएनए टेम्पलेट की आवश्यकता है कि इसका मतलब है </sup>. कम अक्सर इस्तेमाल किया जाता है, सेलुलर mimics के यूकेरियोटिक cells15 से निकाली गई कोशिका के अर्क के साथ बनाया जा सकता है. इस प्रकार अब तक, पर्यावरण भावना है कि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग समझाया cascades और सेलुलर mimics, 16-18 सूचित किया गया है.
प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए सबसे आसान तरीका आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग तत्वों की रोशनी या luminescence के उपाय है. इन विट्रो में प्रतिक्रियाओं अक्सर radiolabeling द्वारा मापा जाता है, हालांकि आमतौर पर, जुगनू luciferase 19 या GFP, उपयोग किया जाता है. प्रतिदीप्ति का पता लगाने के अतिरिक्त जिससे जैविक जैसी प्रक्रियाओं के stochastic प्रकृति में कुछ अंतर्दृष्टि की पेशकश, cytometry आधारित विधियों के माध्यम से फफोले 20,21 की आबादी की निगरानी के लिए अनुमति देता है. इन निगरानी तरीकों मैं के साथ संगत कर रहे हैं कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक संग्रह सहित डिजाइन के नियमों के एक छोटे से सेट और जिसमें से से निर्माण करने के लिए भागों की एक पुस्तकालय, परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएन विट्रो प्रतिलेखन अनुवाद 22, अभिव्यक्ति 22 पर आनुवंशिक संगठन के प्रभाव, सिग्मा कारकों 16 की गतिविधि, और transcriptional terminators के 23 की दक्षता. फिर भी, बहुत विट्रो में उम्मीद के मुताबिक निर्माण की क्षमता, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों को बढ़ाने के लिए किया जाना चाहिए कि वहाँ रहता है.
पुटिका बनाने के लिए उपलब्ध कई तरीके हैं. सबसे आम तरीकों जलीय solution24 में मेजबान द्वारा पीछा एक कांच की सतह पर एक पतली लिपिड फिल्म की पीढ़ी पर निर्भर करती है. जलीय घोल प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी शामिल हैं, उदाहरण के लिए, तो vesicles के एक अंश का गठन प्रोटीन के उत्पादन के लिए आवश्यक घटक शामिल होगा. हालांकि, इस तरह के तरीकों के encapsulation दक्षता vesicles के केवल एक छोटा सा प्रतिशत सक्रिय हैं जिसका अर्थ है कि, कम है. वैकल्पिक तरीकों से कई बहुत अधिक कैप्सूलीकरण eff की विशेषताiciency vesicles के लिए पानी में तेल पायस बूंदों के रूपांतरण का दोहन. यह इस तरह के तरीकों भविष्य में सामान्य हो जाएगा संभावना है, वर्तमान में इन तरीकों के विशेष उपकरण की जरूरत से पीड़ित हैं और बदल झिल्ली रचनाओं के साथ 25 पुटिका दे. पुटिका के तरीकों के लिए पानी में तेल की एक विशिष्ट लाभ झिल्ली lamellarity को नियंत्रित करने की क्षमता है. इस के साथ साथ वर्णित विधि एक अतिरिक्त homogenization के कदम सहित मामूली संशोधनों के साथ Yomo प्रयोगशाला 11 से वर्णित पतली लिपिड फिल्म प्रोटोकॉल पर आधारित है. इस विधि से, आराम से सस्ता है, और अच्छी तरह से प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी के encapsulation के लिए अनुकूल मजबूत पुटिका देता है.
सेल मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान अपनी प्रारंभिक अवस्था में है, अग्रिम जटिल सेल सिस्टम की तरह बनाया जा सकता है, जिसमें से एक नींव रखी है. पुटिका 28 का पूरी तरह से परिभाषित घटकों 9 अंदर से प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी का पुनर्गठन पर्यावरण की दृष्टि से संवेदनशील कृत्रिम cells17, 18 के निर्माण में बाद में प्रयासों को सुविधाजनक बनाने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण था. इसी तरह, कृत्रिम कोशिका अध्ययन विकासवादी प्रक्रियाओं 4,29,30 की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है, यंत्रवत शाही सेना का विवरण और प्रोटीन संश्लेषण 22,31, चयापचय load32, 33 के प्रभाव, और वायरल कणों की 34 विधानसभा. महत्वपूर्ण बात है, पर्याप्त ज्ञान है कि अब बुनियादी सेलुलर समारोह इन पिछली रिपोर्टों और इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का पालन प्रयोगशाला में vesicles के अंदर का पुनर्गठन किया जा सकता है मौजूद है.
, वर्णित encapsulation के जनसंपर्क आसान होने के अलावाocedure कई फायदे हैं. उदाहरण के लिए, कई खाली, lyophilized पुटिका aliquots के अग्रिम में किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. प्रोटोकॉल कार्बनिक विलायकों, कठोर तापमान में परिवर्तन, या डायलिसिस की लंबी अवधि के अधीन नहीं जैविक अणुओं करता है. हम जरूरत के रूप में प्रक्रिया की नम्रता अतिरिक्त घटकों का समावेश की सुविधा होगी कि उम्मीद है. हम भी encapsulation या प्रतिलेखन अनुवाद दक्षता पर झिल्ली के लिपिड संरचना को बदलने के लिए प्रतिकूल प्रभाव देखा नहीं है. इसलिए, झिल्ली प्रोटीन, विशिष्ट morphologies, या दृश्य का समावेश करने के लिए उत्तरदायी लिपिड क़यास शोषण किया जा सकता है.
वर्णित विधि की प्रमुख सीमा परिणामस्वरूप vesicles के आकार या lamellarity में समरूप नहीं हो रहा है. कई अनुप्रयोगों के लिए, इन कठिनाइयों डेटा की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप नहीं करते. अगर जरूरत हालांकि, अतिरिक्त कदम संकीर्ण वें को शामिल किया जा सकता हैई आकार के वितरण और encapsulation के बाद इस तरह के बाहर निकालना के आगे दौर की झिल्ली की परतों, कमी, फ्रीज विगलन, या डायलिसिस 35. इन और अन्य समस्याओं को दरकिनार कि निस्संदेह बेहतर तरीके से विकसित किया जाएगा. तब तक, हम प्रोटोकॉल अच्छी तरह सेलुलर mimics के निर्माण के लिए अनुकूल होने के लिए यहाँ वर्णित हैं.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों Armenise-हार्वर्ड फाउंडेशन, मैरी क्यूरी Trentino COFUND (एसीएस), ट्रेंटो (Ecomm) के स्वायत्त प्रांत है, और धन के लिए CIBIO को स्वीकार करते हैं.
Quick Spin Mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
Spectrometer | NanoDrop 1000 | NDB767ND | |
POPC | Avanti Polar Lipids | 770557 | MW 760 g/mol Transition Temp -2 °C CAS# 26853-31-6 |
Ethanol | Sigma Aldrich | 459836 | Anhydrous, >99.5% |
Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use | Sigma Aldrich | P3803-100mL | Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA |
Chloroform | Biotech Grade Fluka | 496189-1L | Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer |
Brown amber glass bottles | VWR | 89043-518 | 55X 48 mm |
Rotary evaporator | Buchi Rotovapor R-210/Sigma | Z563846EU-1EA | With jack and water bath, 29/32 joint 240 V |
Analog vortex mixer | VWR | 945300 | Speed 1,000-3,200 rpm |
Homogenizer | IKA T10 Basic Ultra-Turbax | 3420000 | |
Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610020 | |
Extruder filters | Whatman | 610014 | drain disc 10 mm |
Extruder polycarbonate membrane 400 nm | Whatman | 61007 | nuclepore polycarbonate |
Speed vacuum | Labconco | 7970011 | Centritrap DNA concentrator |
PURExpress kit | New England Biolabs | NRM #E6800S | |
RNAse inhibitor (40,000 U/ml) | New England Biolabs | #M0307S | |
Proteinase K (20.2 mg/ml) | Fermentas | #EO0491 | |
Microscope | Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera | ||
RealTime | CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad) | ||
Silicon press to seal -Molecular Probe | Life Technologies | P18174 | Resistant from -25-30 °C |
Siliconized glass circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Diameter= 22 mm |
ImageJ | NIH |