एक Hypothalamic सेल मॉडल में apoptosis निर्धारित करने के लिए कस्पासे बहुसंकेतन परख का उपयोग
Summary
मल्टीप्लेक्स assays बुनियादी सेलुलर तंत्र के लिए फायदेमंद जानकारी उपलब्ध कराने और अभिकर्मकों और अनावश्यक दोहराव प्रयोगों की बर्बादी को खत्म कर सकते हैं. हम palmitic एसिड के साथ ऑक्सीडेटिव चुनौती के बाद एक इन विट्रो हाइपोथैलेमस मॉडल में सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, फ्लोरोसेंट और luminescent आधारित विधियों का उपयोग कर, यहाँ एक मल्टीप्लेक्स कस्पासे 3/7 गतिविधि परख का वर्णन.
Abstract
जटिल सेलुलर तंत्र की पढ़ाई में assays मल्टीप्लेक्स क्षमता, दोहराव प्रयोगों के लिए की आवश्यकता समाप्त आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है, और लागत और अभिकर्मकों में बर्बादी कम हो जाती है. यहाँ हम एक 96 अच्छी तरह से व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती और कस्पासे 3/7 गतिविधि को मापने के लिए आधारित assays फ्लोरोसेंट और luminescent दोनों का उपयोग कर, एक में इन विट्रो हाइपोथैलेमस मॉडल में एक palmitic एसिड (पीए) चुनौती के बाद apoptosis का आकलन करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स परख के अनुकूलन का वर्णन microtiter प्लेट स्वरूप. पा चैलेंज के बाद, व्यवहार्य कोशिकाओं एक resazurin आधारित फ्लोरोसेंट परख द्वारा निर्धारित किया गया है. कस्पासे 3/7 गतिविधि एक luminogenic सब्सट्रेट, DEVD, और सेल नंबर के लिए सामान्यीकृत का उपयोग करके निर्धारित था. इस बहुसंकेतन परख ऐसे संतृप्त फैटी एसिड चुनौती के रूप में एक apoptotic प्रोत्साहन, निम्नलिखित कस्पासे गतिविधि में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. संतृप्त फैटी एसिड पीए संभावित importa का संकेत है, हाइपोथैलेमस oxidative तनाव और apoptosis बढ़ा सकते हैंजैसे कि assays के nce संतृप्त फैटी एसिड और neuronal समारोह के बीच संबंधों का अध्ययन करने में यहाँ का वर्णन किया.
Introduction
ऐसे palmitic एसिड (पीए) के रूप में संतृप्त फैटी एसिड में अमीर आहार मोटापा और हृदय रोग और मधुमेह 1, 2 सहित अन्य comorbidities, से जोड़ा गया है. उच्च वसा वाले आहार ऑक्सीडेटिव तनाव, apoptosis, और हाइपोथेलेमस में neuronal अध: पतन, भूख और ऊर्जा व्यय 3-7 का एक महत्वपूर्ण नियामक वृद्धि दर्ज की गई है. उच्च वसा वाले आहार जोखिम हाइपोथैलेमस अनियंत्रण लाती है, जिसके माध्यम से तंत्र को समझना मोटापा के लिए औषधीय उपचार के विकास के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है. हालांकि, आहार वसा neuronal समारोह को प्रभावित करता है, जिसके माध्यम से सेलुलर तंत्र अस्पष्ट रहते हैं. इस तरह के पीए के रूप में वसा हाइपोथैलेमस apoptotic रास्ते की शुरुआत ट्रिगर हो सकता है की एक बेहतर समझ इस उद्देश्य की ओर एक आवश्यक पहला कदम है. इस अनुच्छेद के लक्ष्य घंटे की पढ़ाई में इस्तेमाल के लिए विकसित पीए प्रदर्शन करने के लिए neuronal प्रतिक्रिया की इन विट्रो में परीक्षण के लिए एक मल्टीप्लेक्स परख, का वर्णन करने के लिए हैypothalamic neurodegeneration. हम देहात 8 के साथ ऑक्सीडेटिव चुनौती के बाद (A12 नामित) एक विभेदित अमर वयस्क माउस हाइपोथैलेमस सेल लाइन में कोशिकाओं की कुल संख्या प्रति 3/7 गतिविधि कस्पासे मापने के लिए इन विट्रो 96 अच्छी तरह प्रारूप मल्टीप्लेक्स परख का विस्तृत विवरण उपलब्ध कराते हैं.
संक्षेप में, सेल व्यवहार्यता एक resazurin आधारित परख के माध्यम से पा चैलेंज निम्न निर्धारित किया जाता है. Resazurin metabolically सक्रिय कोशिकाओं में एंजाइमी कमी से होकर गुजरती है कि एक सेल पारगम्य यौगिक है, सोचा था कि एक प्रक्रिया mitochondria 9 के माध्यम से होते हैं. व्यवहार्य कोशिकाओं लगातार व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के अनुपात एक फ्लोरोसेंट संकेत उत्पादन, resorufin को resazurin परिवर्तित. कस्पासे 3/7 गतिविधि तो एक DEVD आधारित lumogenic परख का उपयोग कर विश्लेषण किया है. DEVD कस्पासे -3 द्वारा cleaved एक एमिनो एसिड अनुक्रम (एएसपी ग्लू-वैल एएसपी) है. इस क्रम intracellular कस्पासे 3/7 के सक्रियण और बाद में दरार पर, एक lumogenic पदार्थ के लिए युग्मित है जबDEVD सब्सट्रेट, luminescent उत्पाद जारी की है. यह प्रतिक्रिया कस्पासे गतिविधि करने के लिए और इस तरह apoptosis के शामिल होने के लिए आनुपातिक है. मृत कोशिकाओं कस्पासे का उत्पादन नहीं कर सकते हैं, कस्पासे 3/7 गतिविधि प्रकृति क्षणिक से है; इसलिए विश्लेषण सेल तनाव के प्रभाव पर निर्भर करता है, 4 घंटा बाद चुनौती को 30 मिनट के बीच पूरा किया जाना चाहिए. सेल व्यवहार्यता कस्पासे 3/7 गतिविधि के विपरीत आनुपातिक है और कोशिका मृत्यु के तंत्र को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इस पद्धति पहले से orexin इस उपचार से प्रभावित तंत्र oxidative नुकसान 10 के खिलाफ की रक्षा करने में महत्वपूर्ण हैं, सुझाव है कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ चुनौती दी hypothalamic कोशिकाओं में apoptosis को कम कर देता पेप्टाइड हार्मोन के साथ कि pretreatment दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह वे परख अभिकर्मकों कम करने के लिए mitochondrial गतिविधि पर निर्भर के रूप में इन assays, सेल लाइन और ऊतक पर निर्भर कर रहे हैं नोट करना महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल वयस्क माउस हाइपोथैलेमस (A12) कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है; हालांकि,वर्णित विधियों इसी तरह के अनुसंधान के दायरे के भीतर फिट करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है.
एक ही संस्कृति से बहुसंकेतन assays अच्छी तरह से कई कारणों से व्यक्तिगत assays के प्रदर्शन की पारंपरिक विधि एक से अधिक लाभ प्रदान करता है. समय, सेल के नमूने, और संस्कृति अभिकर्मकों बचत के अलावा, बहुसंकेतन assays भी, सेल अस्तित्व और मृत्यु का ज्ञान प्रदान आंतरिक नियंत्रण प्रदान करते हैं, और दोहराव प्रयोगों 11, 12 के लिए की आवश्यकता को समाप्त कर सकते हैं.
वैकल्पिक तरीकों एक 96 अच्छी तरह प्रारूप का उपयोग, खासकर जब विश्वसनीय assays हैं जो पश्चिमी blots या ELISAs, पर भरोसा किया, लेकिन महंगा है और समय लेने वाली (1-2 दिन) हैं. यह बहुसंकेतन परख के लिए संस्कृति कोशिकाओं में लगने वाले समय को छोड़कर, कुल समय कम से कम 3 घंटा है. इस प्रोटोकॉल A12 कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है जबकि सेल अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं कि मन कारकों में रखते हुए, यह अन्य मॉडलों में इस्तेमाल के लिए परिवर्तित किया जा सकता है. रोकनाइस प्रोटोकॉल प्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए काम करेगा अगर खनन नमूने या प्रयोगात्मक शर्तों की संख्या पर योजना बनाई और नीचे की ओर प्रयोगों पर पर निर्भर करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
मल्टीप्लेक्स परख ऐसी पीसीआर प्रोटीन, immunodetection, और अन्य प्रोटीन आधारित तरीकों का पता लगाने 13, 14 के रूप में कई अनुप्रयोगों में वैज्ञानिकों द्वारा इस्तेमाल किया गया है कि एक अच्छी तरह से स्वीकार तकनीक है….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहाँ वर्णित काम दिग्गजों मामलों के अमेरिकी विभाग बायोमेडिकल प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास BX001686-1A1 और वीए पुनर्वास अनुसंधान और विकास द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
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