Användning av en kaspas Multiplexing Assay att Bestäm Apoptos i en Hypotalamus Cell Model
Summary
Multiplex-analyser kan ge bra information om grundläggande cellulära mekanismer och eliminera slöseri med reagenser och onödiga upprepade experiment. Vi beskriver här en multiplex-kaspas-3/7 aktivitetsanalys, genom att använda fluorescens och luminiscerande baserade metoder, för att bestämma cellviabilitet i en in vitro hypotalamisk modell följande oxidativa utmaning med palmitinsyra.
Abstract
Förmågan att multiplexa analyser i studier av komplexa cellulära mekanismer eliminerar behovet av upprepade experiment, ger den interna kontrollen, och minskar avfallet i kostnader och reagenser. Här beskriver vi en optimering av en multiplex-analys för att bedöma apoptos efter en palmitinsyra (PA) utmaning i en in vitro hypotalamisk modell, med användning av både fluorescerande och luminiscerande baserade analyser för att mäta livskraftiga celler och kaspas-3/7-aktivitet i en 96-brunnars mikrotiterplattformat. Efter PA utmaning, var livsdugliga celler bestäms av en resazurin baserat fluorescerande analys. Caspas-3/7 aktivitet var då bestämmas med hjälp av en luminogena substrat, DEVD, och normaliserade till cell nummer. Denna multiplexering analys är en användbar teknik för att bestämma förändringen av kaspas-aktivitet efter en apoptotisk stimulans, såsom mättad fettsyra utmaning. Den mättade fettsyror PA kan öka hypotalamus oxidativ stress och apoptos, vilket indikerar den potentiella importiou av analyser, såsom den som beskrivs här för att studera förhållandet mellan mättade fettsyror och neuronal funktion.
Introduction
Kost rik på mättade fettsyror såsom palmitinsyra (PA) har kopplats till fetma och andra sjukdomstillstånd, bland annat hjärt-och kärlsjukdomar och diabetes 1, 2. Fettrik kost har också visat sig öka oxidativ stress, apoptos, och neuronal degenerering i hypotalamus, en viktig regulator av aptit och energiförbrukning 3-7. Att förstå den mekanism genom vilken fettrik kost exponering inducerar hypotalamus dysregulation är därför viktigt för utvecklingen av farmakologiska behandlingar för fetma. Men de cellulära mekanismer som fett påverkar neuronal funktion fortfarande oklara. En bättre förståelse för hur fett liksom PA kan utlösa uppkomsten av hypotalamus apoptotiska vägar är ett nödvändigt första steg mot detta mål. Målet med denna artikel är att beskriva en multiplex analys för in vitro-testning av neuronal svar på PA-exponering, som utvecklats för att användas i studier av hypothalamic neurodegeneration. Vi tillhandahåller en detaljerad beskrivning av en in vitro-96-brunnsformat multiplex-analys för att mäta kaspas 3/7 aktivitet per totala antalet celler i ett differentierat immortaliserad vuxen mus hypotalamisk cellinje (betecknad A12) efter oxidativ utmaning med PA 8.
I korthet är cellviabiliteten bestäms efter PA utmaning via en resazurin baserad analys. Resazurin är en cell permeabel förening som undergår enzymatisk reduktion i metaboliskt aktiva celler, ett förfarande tros ske via mitokondrierna 9. Viabla celler omvandlar kontinuerligt resazurin till resorufin, som producerar en fluorescerande signal som är proportionell mot antalet viabla celler. Caspas-3/7 aktivitet analyseras sedan med användning av ett DEVD-baserad lumogenic assay. DEVD är en aminosyrasekvens (Asp-Glu-Val-Asp) klyvs av kaspas-3. När denna sekvens är kopplad till en lumogenic ämne, vid aktivering av intracellulär kaspas-3/7 och efterföljande klyvningav DEVD substrat, är den självlysande produkten släpps. Denna reaktion är proportionell mot kaspas-aktivitet och därmed till induktionen av apoptos. Som döda celler inte kan producera kaspas är kaspas-3/7 aktivitet av naturen övergående; Därför analys bör kompletteras mellan 30 minuter till 4 timmar efter utmaning, beroende på effektiviteten i cellstressfaktor. Cellviabilitet är omvänt proportionell mot kaspas-3/7-aktivitet och kan användas för att bestämma mekanismen av celldöd. Exempelvis har denna metod som tidigare använts för att visa att förbehandling med peptidhormonet orexin minskar apoptos i hypotalamiska celler utmanade med väteperoxid, vilket tyder på att mekanismer som påverkas av denna behandling är viktiga för att skydda mot oxidativ skada 10. Det är viktigt att notera dessa analyser är cellinje-och vävnadsberoende, eftersom de förlitar sig på mitokondriell aktivitet att minska analysreagens. Detta protokoll har optimerats för vuxen mus hypothalamus (A12)-celler; dockbeskrivna metoderna kan ändras för att passa inom ramen för liknande forskning.
Multiplexing analyser från en enda odlingsbrunn erbjuder en fördel jämfört med den traditionella metoden för att utföra individuella analyser av flera skäl. Förutom att spara tid, cellprover och reagens kultur, kan multiplexering analyser också ge kunskap om cellöverlevnad och död, ge intern kontroll, och eliminerar behovet av upprepade experiment 11, 12.
Alternativa metoder har förlitat oss på Western-blottar eller ELISA, som är tillförlitliga analyser, men är dyra och tidskrävande (1-2 dagar), i synnerhet vid användning av en 96-brunnsformat. Med undantag av den tid det tar att odla celler för multiplexering analys är den totala tid mindre än 3 timmar. Även om detta protokoll har optimerats för användning med A12-celler, kan det ändras för att användas i andra modeller och samtidigt tänka på faktorer som kan påverka cellernas integritet. Detergruvdrift om detta protokoll skulle fungera för en serie experiment beror på antalet prover eller experimentella förhållanden och på efterföljande experiment planeras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den multiplex analys är en väl accepterad teknik som har använts av forskare i ett flertal applikationer som PCR-microarrays, immunodetection och andra proteinbaserade detektionsmetoder 13, 14. Nyligen har multiplexering analyser blivit alltmer utnyttjas i de vitro plattbaserade experiment och har validerats som en säker metod för att bedöma cytotoxicitet och viabilitet 12. I ovanstående protokoll, visar vi hur effektiv multiplexering lysrör och självlysande analyser för…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet beskrivs här har finansierats av US Department of Veterans Affairs Biomedicinsk laboratorie forskning och utveckling BX001686-1A1 och VA rehabiliteringsforskning och utveckling.
Materials
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5′ monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
