Att använda RNA-interferens för att undersöka det medfödda immunsvar i musmakrofager
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
I detta protokoll, beskriver vi effektiva metoder för att hämma gener i musen makrofagcellinjer använder siRNA och övervaka effekterna av dessa behandlingar på det medfödda immunsvaret. Dessa procedurer utförs i 96-format som möjliggör RNAi skärmar i medel- eller hög genomströmning fashion.
Som svar på infektion, människor montera en omedelbar medfödda immunsvar och en långsammare men mer specifik adaptiva immunsvaret. Denna snabba medfödda immunsvar innefattar rekrytering och aktivering av fagocyterande medfödda immunceller inkluderande makrofager 1. Klassiskt aktiverade makrofager är inblandade i akuta inflammatoriska reaktioner och producera antimikrobiella proteiner och föreningar, cytokiner och kemokiner och presentera antigen 2,3. Alternativt aktiverade makrofager spelar en roll i regleringen av immunitet, bibehålla tolerans, vävnadsreparation, och sårläknings 4-8. På grund av deras breda utbud av funktionerKan makrofager spela en roll i ett stort antal sjukdomar inklusive ateroskleros, artrit och cancer 9. Sålunda har studier av makrofager varit ett viktigt område för forskning under en tid i en mängd olika områden sjukdoms.
Trots deras betydelse i det medfödda immunsvaret, kan makrofager vara utmanande celler att arbeta med. I synnerhet är det svårt att få en effektiv transfektion med hjälp av lipid reagens i makrofager utan tillhörande toxicitet 10,11. Även när siRNA effektivt levereras till makrofager, kan robustheten RNAi-inducerad gen knockdown ofta vara ganska måttlig och kan variera från gen till gen.
För att undanröja dessa tekniska utmaningar har vi optimerat transfektion och knockdown tekniker 12-16 i två mus makrofagcellinjer, RAW264.7 17 och J774A.1 18. Detta tillvägagångssätt använder Amaxa Nucleofector 96-brunnars Transfersystem för transfektion; detta systemanvänder en kombination av specialiserade reagens och elektroporering för att transfektera celler i 96-brunnsformat 19. Efter transfektion, vi beskriver metoder för att maximera cell återhämtning och livskraft och för att maximera efterföljande siRNA-inducerad gen knockdown. För att illustrera användbarheten av detta tillvägagångssätt, beskriver vi ett protokoll för siRNA leverans till dessa makrofagcellinjer, stimulera dessa celler med lipopolysackarid (LPS), och övervaka det medfödda immunsvaret på produktionsnivå av flera pro-inflammatoriska cytokiner. Vi tillhandahåller exempeldata där vi riktar Toll-like receptor (TLR) familj, vars medlemmar känner LPS och andra patogener associerade molekylära mönster (PAMPs), för att reglera medfödd immunitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett flertal studier har publicerats där enskilda gener har måltavla siRNA i murina makrofager. Även lipid-medierad transfektion har använts för att leverera siRNA till makrofagcellinjer på individuell basis, dessa metoder lider potentiella effekter på lönsamheten, begränsad gen knockdown, och variationen från gen till gen. För att utveckla mer robusta analyser som kan användas för att rikta in gener i medel- eller hög genomströmning mode, optimerad vi tekniker som använder den Amaxa Nucleofector 96-brunn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. . The innate immune response to infection. , (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. . The macrophage. , (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Génétique. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. . Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).
