माउस मैक्रोफेज में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप का प्रयोग
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
इस प्रोटोकॉल में, हम siRNAs का उपयोग माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों में जीन को बाधित और सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर इन उपचार के प्रभाव पर नजर रखने के लिए कारगर तरीकों का वर्णन. इन प्रक्रियाओं मध्यम या उच्च throughput फैशन में आरएनएआई स्क्रीन के लिए अनुमति देता है, 96 अच्छी तरह प्रारूप में प्रदर्शन कर रहे हैं.
संक्रमण के जवाब में, मनुष्य एक तत्काल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एक धीमी लेकिन अधिक विशिष्ट अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट. यह तेजी से सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मैक्रोफेज 1 सहित phagocytic सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती और सक्रियण शामिल है. प्रतिष्ठित सक्रिय मैक्रोफेज तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में शामिल और रोगाणुरोधी प्रोटीन और यौगिकों, साइटोकिन्स और chemokines, और वर्तमान एंटीजन 2,3 का उत्पादन कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज सहिष्णुता, ऊतकों की मरम्मत को बनाए रखने, प्रतिरक्षा को विनियमित करने में एक भूमिका निभाते हैं, और 4-8 घाव भरने. क्योंकि कार्यों की उनके ठहरने का, मैक्रोफेज atherosclerosis, गठिया, और कैंसर 9 सहित कई बीमारियों में एक भूमिका निभा सकते हैं. इस प्रकार, मैक्रोफेज का अध्ययन रोग क्षेत्रों की एक विस्तृत विविधता में कुछ समय के लिए अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र रहा है.
सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में उनके महत्व के बावजूद, मैक्रोफेज के साथ काम करने के लिए कोशिकाओं को चुनौती देने जा सकता है. विशेष रूप से, यह जुड़े विषाक्तता 10,11 बिना मैक्रोफेज में लिपिड अभिकर्मकों का उपयोग कुशल अभिकर्मक प्राप्त करना कठिन है. इसके अलावा, siRNA कुशलता से मैक्रोफेज के लिए दिया जाता है, तब भी जब अक्सर पछाड़ना आरएनएआई प्रेरित जीन की मजबूती काफी उदार हो सकता है और जीन जीन से भिन्न हो सकती हैं.
इन तकनीकी चुनौतियों पर काबू पाने के लिए, हम दो माउस बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों, RAW264.7 17 और J774A.1 18 में अभिकर्मक और पछाड़ना तकनीक 12-16 अनुकूलित है. यह दृष्टिकोण अभिकर्मक के लिए Amaxa Nucleofector के 96 अच्छी तरह से शटल प्रणाली का उपयोग करता है; इस प्रणाली96 अच्छी तरह प्रारूप 19 में कोशिकाओं transfect करने के लिए विशेष अभिकर्मकों और electroporation की एक संयोजन का उपयोग करता है. अभिकर्मक के बाद, हम तरीकों सेल वसूली और व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए और बाद में siRNA प्रेरित जीन पछाड़ना को अधिकतम करने का वर्णन है. इस दृष्टिकोण की उपयोगिता को वर्णन करने के लिए, हम lipopolysaccharide (LPS) के साथ इन कोशिकाओं को उत्तेजित, और कई समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन के स्तर पर सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर नजर रखने, इन बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों को siRNA वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम जिसके सदस्य LPS और अन्य रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) भावना, सहज प्रतिरक्षा को विनियमित करने के लिए टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) परिवार, जो लक्ष्य में नमूना डेटा प्रदान करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
कई अध्ययनों में जो व्यक्ति जीन murine मैक्रोफेज में siRNA द्वारा लक्षित किया गया है प्रकाशित किया गया है. लिपिड की मध्यस्थता अभिकर्मक एक व्यक्ति के आधार पर बृहतभक्षककोशिका सेल लाइनों को siRNA देने के लिए इस्तेम?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
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