ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ
Summary
組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要があります。
Abstract
組換えヒトMHC II分子と生化学的ア ッセイは、免疫原性エピトープ同定、削除、またはデザイン1,2に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここでは、ペプチド-MHC II結合アッセイを、384ウェルフォーマットにスケーリングされる。縮小されたプロトコルは、75％の試薬 コストを削減し、以前に、96ウェル·プロトコル1,3-5記載よりも高いスループットである。具体的には、実験的なデザインは、384ウェルELISAプレートにつき1 MHC IIアレルに対して最大15のペプチドの堅牢で再現性のある分析が可能。単一液体処理ロボットを用いて、この方法は、1つの研究者が、48時間未満の8濃度四II MHC対立遺伝子型の範囲にわたって三連で約90試験ペプチドを分析することができます。タンパク質脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で活躍する他のプロトコルが自分の仕事を促進するのに有用であることが見つけることができます。具体的には、ステップ·バイ·ステップの手順と視覚フォーマットJoveの他のユーザーが迅速かつ簡単に、自分の研究室で、この方法論を確立できるようにする必要があります。
Introduction
タンパク質は、治療薬6の最も急成長しているクラスであり、生物学的治療のパイプラインの急速な拡大は、タンパク質薬剤の開発および使用に関連した課題にますます注目が集中している。 One固有の考慮事項は、健康で機能する免疫系では、全ての細胞外タンパク質は、抗原提示細胞（APC）によってサンプリングされるという事実から生じる。一旦APCにより内部移行、タンパク質は、小ペプチドフラグメントに切断され、推定上の免疫原性のセグメントは、クラスII主要組織適合複合体タンパク質（MHC II）の溝にロードされる。ペプチド-MHC II複合体は、次いで、APCの表面に表示され、真の免疫原性ペプチドは、同族のCD4 T細胞表面受容体7との三元MHC II-ペプチド-T細胞受容体複合体を形成し、T細胞エピトープと呼ばれる。この臨界分子認識事象は、T細胞活性化をもたらす複雑なシグナル伝達カスケード、サイトカインの放出を開始するS、CD4 T細胞媒介B細胞の成熟とに結合して、問題のある外因性タンパク質をクリアしたIgG抗体を循環させる、最終的に生産。このように、免疫原性タンパク質は、構成のT細胞エピトープを同定およびMHC II複合体形成の原因の重要な残基を変異させることにより脱免疫化される可能性があります。これは、T細胞エピトープは、多数の広く免疫原性タンパク質全体に分散することができることは、注目に支持、およびエピトープ削除突然変異の大部分は、タンパク質機能または安定性の不慮の損失を引き起こす可能性がある。そのため、工学は生物学的療法は複雑で技術的に困難な客観的可能脱免疫が、成功したT細胞エピトープの削除プロジェクト3,5,8-12のいくつかの例が存在する。主に抗体治療薬に限定されている移植ベースの「ヒト化」とは異なり、エピトープの削除は関係なく、配列、構造、機能の本質的に任意のタンパク質標的に適用することも、homologoの可用性私たち人間の足場。このようなアプローチを実装するための最初のステップは、標的タンパク質配列内に埋め込まれた鍵ペプチドエピトープの同定である。
合成ペプチドおよび組換えヒトMHC II分子を用いた高スループット生化学アッセイは、エピトープ同定と緩和1,3-5への迅速な予備的な洞察を提供することができます。これらのELISA型アッセイは、他のタンパク質/ワクチン設計および開発ツールへの強力な補完することができます。例えば、エピトープマッピングに1十分に確立された実験的なアプローチは、時間、労力に依存しており、集中的なex vivoでの細胞増殖アッセイ15リソース 。簡単に言えば、標的タンパク質の一次配列は、最初の重複ペプチドのパネルに分割され、12残基と、多くの場合、15量体は、隣接するペプチドとの間で重複している。ペプチドのパネルは、化学的に合成され、各ペプチドの免疫原性は、Blooの周辺を用いるいくつかの異なるイムノアッセイのいずれかで試験するd個の単核細胞（PBMC）、ヒトのドナーから単離された13,14。検索結果においてより大きな信頼性を提供するために、ペプチドは、典型的には50以上の異なるドナーからのPBMCを使用してレプリケートで試験する。脱免疫化は、究極の目的である場合において、作業が変異したペプチドの追加のパネルを生産し、その後の機能解析10のために、全長タンパク質内の任意の脱免疫化変異を導入する前に、PBMCアッセイにおいて新規なペプチドのパネルを試験する必要性によってさらに悪化する。これらの細胞アッセイは、ヒト患者における免疫原性を評価するためのゴールドスタンダードまま、このような徹底的なアプローチの効率は、迅速かつ高スループットMHC II-ペプチド結合アッセイを用いて推定される免疫原性エピトープをプレフィルタリングすることによって改善される可能性があります。
同様に、生化学的ペプチド-MHC II結合アッセイは、ラジカルエピトープ同定プロセスを加速するためにインシリコにおける予測方法と組み合わせることができる。T細胞エピトープ予測のための計算のさまざまなツールが存在し、その例は、のProPred 16が含まれ、MHCPred 17、SVRMHC 18、ARB 19、20を SMM-揃え、NetMHCIIpan 21だけでなく、EpiVax 22によるこのようなエピマトリックスなどの独自のツール。同様に、エピトープ予測因子は最近、脱免疫変異は、タンパク質の構造と機能23〜26を崩壊させる可能性があるリスクを軽減するために設計された統合タンパク質脱免疫アルゴリズムを得るために、他のバイオインフォマティクスと分子モデリングツールと統合されました。いくつかのエピトープ予測因子が合理的に正確27,28であることが証明されているが、計算結果は、常に実験的な検証が必要。迅速な高スループット、費用効果的な実験方法は、インシリコエピトープ予測内の予備フィルターとして最適です。
同じような文脈では、エピトープ予測因子は、逆vaccinoloための抗原選択を駆動することができますGY 29,30。例えば、バイオインフォマティクスの進歩が急激に病原体プロテオームから抽出された全タンパク質又はペプチドエピトープの形でワクチン候補を同定する全ゲノムスクリーニングをもたらした。これを可能にする技術は、保護ワクチンの発見と開発を再形成されているが、免疫原性のワクチン候補の頑丈に大規模なリストの形で新たな挑戦を紹介します。ハイスループットペプチド-MHC II結合アッセイは、ペプチド結合親和性を定量化し、複数のMHC II対立遺伝子の中で乱雑に結合することによって、エピトープの選択を導くことができる。タンパク質脱免疫を持つように、このような実験方法は、最終的に有望なワクチンリードの計算予測を検証するために必要とされる。
ここで、384ウェルフォーマットにスケーリングされたペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。プロトコルは、高度に並列化され、以前に、96ウェルプレートフォーマット1,3-5記載と比較して75％試薬コストを削減する。シングルリキを使用したDハンドリングロボットは、このメソッドは1研究者が簡単に8濃度未満48 HRの4 MHC II対立遺伝子型の範囲に渡って三連で約90試験ペプチドを分析することができます。この記事では、1 MHC IIアレルに対する7実験ペプチドの分析のための1の384ウェルELISAプレートのセットアップについて説明するが、容易に所望のペプチドおよび/またはMHC任意の数の実験をスケールするように広がったシート電卓は、補足資料として提供されているII分子。
Protocol
Representative Results
Discussion
バイオ医薬品は、2012年32でトップ5の販売薬の4を表す、現代医学の礎としての地位を確立している。生物薬剤学部門は数年前から6のために持続的な成長を示しており、新規薬剤の継続的な開発だけでなく、バイオシミラーの出現は、バイオ医薬品のパイプラインを拡大してきました。将来的に見ると、タンパク質治療薬の免疫原性を評価し、軽減することは、初期段階の生物…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの助成金R01-GM-098977およびCBKとKEGにR 21-AI-098122によってサポートされていました。 RSSは、工学部のセイヤースクールセイヤーイノベーションプログラムフェローシップによってルース財団フェローシップにより部分的には部分的にサポートされていました。
Materials
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Sigma | 221732 | |
| Citric Acid | Sigma | C1901 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| Octyl-β-D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco’s 10X Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA Assay Buffer | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA Enhancement Buffer | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Europium Labelled Streptavidin | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 anti-HLA-DR antibody | Biolegend | 307602 | |
| Biotinylated tracer peptides | 21st Century Biochemicals | Custom Order | |
| Test peptides (1-4mg, 85% purity) | Genscript | Custom Order | |
| Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) | Benaroya Research Institute* | Custom Order | |
| 384-well white EIA/RIA plate | Thermo | 460372 | |
| Polypropylene 384-well plate | Costar | 3656 | |
| Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator | Axygen Asicentific | PCR-SP | |
| MilliQ Water | N/A | N/A | |
| Epimotion Liquid Handler (or similar) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (or similar) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) | Molecular Devices | N/A | |
| *Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory | |||
References
- Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
- Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
- Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
- Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
- Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
- Aggarwal, S. R. What’s fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
- Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
- Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
- Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
- Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
- Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
- Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
- Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
- Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
- Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
- Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
- Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
- Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 – Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
- De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
- Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
- Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
- Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
- Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
- De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
- Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
- Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
- Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
- Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
- . Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
- Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
- Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
- Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).
