के लिए endothelial सेल ट्यूब गठन परख<em> इन विट्रो</em> Angiogenesis के अध्ययन
Summary
ट्यूब गठन परख इन विट्रो angiogenesis को मापने के लिए एक तेज, मात्रात्मक विधि है. Endothelial कोशिकाओं वातानुकूलित मीडिया के साथ संयुक्त और तहखाने झिल्ली निकालने पर चढ़ाया जाता है. ट्यूब गठन घंटे के भीतर होता है और नवगठित नलिकाओं आसानी मात्रा निर्धारित.
Abstract
एंजियोजिनेसिस सामान्य ऊतक विकास और घाव भरने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, लेकिन यह भी रोग की स्थिति की एक किस्म के साथ जुड़ा हुआ है. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, angiogenesis एक तेज, quantifiable तरीके से इन विट्रो में मापा जा सकता है. प्राथमिक या अमर endothelial कोशिकाओं वातानुकूलित मीडिया के साथ मिलाया और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर चढ़ाया जाता है. endothelial कोशिकाओं वातानुकूलित मीडिया में पाया वाहिकाजनक संकेतों के जवाब में संरचनाओं की तरह केशिका के रूप में. ट्यूब गठन endothelial कोशिकाओं 1 घंटा और लुमेन युक्त नलिकाओं 2 घंटे के भीतर दिखाई शुरुआत के भीतर खुद के लिए पंक्ति में शुरुआत के साथ जल्दी होता है. ट्यूब एक चरण विपरीत उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखे जा सकते हैं, या कोशिकाओं प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना परख और ट्यूब से पहले calcein AM के साथ इलाज किया जा सकता है. शाखा साइटों / नोड्स की संख्या छोरों / meshes, या संख्या या गठन ट्यूब की लंबाई आसानी vitr में से एक उपाय के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैओ angiogenesis. संक्षेप में, यह परख जीन और एक, तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और मात्रात्मक तरीके से पदोन्नति या angiogenesis के निषेध में शामिल कर रहे हैं कि रास्ते की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
एंजियोजिनेसिस, preexisting जहाजों से नई रक्त वाहिकाओं के विकास, 1-3 उपचार अंग विकास, भ्रूण विकास, और घाव सहित प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए महत्वपूर्ण है. नव ऊतकों को endothelial कोशिकाओं, आपूर्ति ऑक्सीजन और पोषक तत्वों से अटे रक्त वाहिकाओं, विकसित, hematopoietic कोशिकाओं द्वारा प्रतिरक्षा निगरानी को बढ़ावा देने और अपशिष्ट उत्पादों 2,4 हटा दें. एंजियोजिनेसिस भ्रूण और भ्रूण के विकास के दौरान प्रमुख महत्व का है. हालांकि, इस प्रक्रिया घाव भरने, कंकाल विकास, गर्भावस्था के समय के दौरान छोड़कर या मासिक धर्म चक्र 1-3 के दौरान वयस्क में निष्क्रिय बनी हुई है.
पिछले दो दशकों में, angiogenesis को विनियमित कि कुंजी आणविक तंत्र में उभरने के लिए शुरू कर दिया है. एंजियोजिनेसिस integrins, chemokines, angiopoietins, ऑक्सीजन संवेदन एजेंट, junctional अणुओं और अंतर्जात अवरोधकों 5 सहित समर्थक और antiangiogenic संकेतों से संतुलित एक कसकर विनियमित घटना है. Proang बारऐसे बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF), प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक (PDGF), और epidermal वृद्धि कारक (EGF) के रूप में iogenic संकेतों endothelial सेल endothelial कोशिकाओं तहखाने झिल्ली नीचा करने के लिए proteases जारी रिसेप्टर्स को सक्रिय करें. endothelial कोशिकाओं तो दिन 6,7 प्रति कई मिलीमीटर की दर से अंकुरित गठन पैदा करना और विस्थापित.
Angiogenesis कैंसर, सोरायसिस, मधुमेह रेटिनोपैथी, गठिया, अस्थमा, autoimmune विकार, संक्रामक रोगों, और atherosclerosis 8-10 सहित विभिन्न रोग की स्थिति के साथ जुड़ा हुआ है. कारण विभिन्न रोगों में angiogenesis के महत्व, इस प्रक्रिया को बेहतर चिकित्सा विज्ञान के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है कि विनियमित जीन और रास्ते को समझने के लिए.
ट्यूब गठन परख angiogenesis में शामिल जीन या रास्ते का निर्धारण करने के लिए एक तेजी से और मात्रात्मक विधि है. सबसे पहले 1988 में वर्णित है,इस परख सिद्धांतों endothelial कोशिकाओं के विभाजन और वाहिकाजनक संकेतों 11-13 के जवाब में तेजी से विस्थापित करने की क्षमता बनाए रखने के लिए कर रहे हैं कि. इसके अलावा, endothelial कोशिकाओं अंतर और तहखाने झिल्ली निकालने (बीएमई) के एक मैट्रिक्स पर जब सुसंस्कृत ट्यूब संरचनाओं की तरह फार्म करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं. इन ट्यूबों junctional परिसरों के माध्यम से एक साथ जुड़े endothelial कोशिकाओं से घिरा हुआ एक लुमेन होते हैं. ट्यूब गठन के सबसे ट्यूब मात्रा और वाहिकाजनक उत्तेजनाओं के प्रकार के आधार पर 2-6 घंटे के भीतर इस परख में गठन के साथ जल्दी होता है.
Endothelial कोशिकाओं के कई प्रकार के प्राथमिक कोशिकाओं और अमर सेल लाइनों 14,15 सहित दोनों इस परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस लेख के लिए इस्तेमाल सेल लाइन माउस 3B-11 था, लेकिन एक ही पद्धति ऐसी HUVEC (मानव) कोशिकाओं के रूप में इस तरह के SVEC4-10 (माउस) के रूप में अन्य endothelial सेल लाइनों या प्राथमिक endothelial कोशिकाओं के साथ लागू किया जा सकता है. जो के आधार पर सेल लाइन का इस्तेमाल किया जाता है और endothelial CE चाहेLLS तब्दील या गैर बदल रहे हैं, अनुकूलन उचित ट्यूब गठन के लिए आवश्यक आदर्श समय की पहचान करने के लिए आयोजित किए जाने की आवश्यकता होगी.
Protocol
Representative Results
Discussion
एंजियोजिनेसिस शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं दोनों में शामिल है. Angiogenesis में शामिल तंत्र के अध्ययन के angiogenesis में प्रमुख कदम पुनरावृत्ति कि assays के उपयोग की आवश्यकता है. endothelial सेल ट्यूब गठन परख अन्य assays पर कई लाभ प्र…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित है, और NCI द्वारा UA5CA152907 अनुदान दिया गया था.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
- Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
- Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
- Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
- Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
- Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
- Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
- Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
- Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , 144-521 (1950).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
