のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em>体外</em>血管新生に関する研究
Summary
管形成アッセイは、 インビトロ血管新生を測定するための高速、定量可能な方法である。内皮細胞は、馴化培地と混合し、基底膜抽出物でメッキされる。管形成は容易に定量時間と新たに形成された細管内で発生する。
Abstract
血管新生は、正常な組織発達および創傷治癒に不可欠なプロセスであるが、病理学的状態の多様な関連付けられている。このプロトコルを使用して、血管形成は、高速、定量化可能な方法でインビトロで測定することができる。一次または不死化内皮細胞馴化培地と混合し、基底膜マトリックス上に播種される。内皮細胞は、馴化培地中に見出さ血管新生信号に応答して、毛細血管様構造を形成する。管形成は、内皮細胞は、1時間とルーメンを含む細管を2時間以内に出始め以内に自分自身を整列し始めてすぐに発生します。チューブは、位相差倒立顕微鏡を用いて可視化することができ、または細胞が、蛍光または共焦点顕微鏡を介して可視化アッセイチューブに先立っカルセインAMで処理することができる。ブランチサイト/ノードの数は、/メッシュをループし、または形成された管の数または長さを容易にvitrでの測定値として定量化することができるO血管新生。要約すると、このアッセイは、迅速な再現可能な、そして定量的に血管形成の促進または阻害に関与する遺伝子および経路を同定することができる。
Introduction
血管新生、既存血管からの新しい血管の発達は、1〜3治癒 、器官の成長、胚発生、創傷を含めた多様なプロセスに不可欠である。新組織に内皮細胞、供給酸素と栄養が並ん血管を開発し、造血細胞による免疫監視を促進し、老廃物2,4を削除します。血管新生は、胚および胎児の発生の間に極めて重要である。しかしながら、この方法は、創傷治癒、骨格の成 長、妊娠や月経周期1-3時の回の中を除いて、成人に休眠残る。
最後の20年間、血管新生を制御する重要な分子機構が出現し始めている。血管新生は、インテグリン、ケモカイン、アンジオポエチン、酸素検知剤、接合部の分子と内因性阻害5を含むプロと抗血管新生シグナルでバランスが厳密に調節イベントです。 proangいったんそのような塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、および上皮成長因子（EGF）などのイオ起源の信号は、内皮細胞は、内皮細胞が基底膜を分解するプロテアーゼを放出するレセプター活性化する。内皮細胞はその後増殖し、遊走、6,7日あたり数ミリメートルの速度で芽を形成する。
血管新生は、癌、乾癬、糖尿病性網膜症、関節炎、喘息、自己免疫疾患、感染症、およびアテローム性動脈硬化症8-10を含むさまざまな病的状態と関連している。による各種疾患における血管新生の重要性は、このプロセスは、より良い治療法の設計に重要である調節遺伝子および経路を理解する。
管形成アッセイは、血管形成に関与する遺伝子または経路を決定するための迅速かつ定量的な方法である。まず1988年に記載され、このアッセイの基礎をなす原則は、内皮細胞が分裂し、血管新生シグナルに応答11-13に急速に移行する能力を保持するということである。さらに、内皮細胞は分化し、基底膜抽出物（BME）のマトリックス上で培養管様構造を形成するように誘導される。これらの管は、接合部複合体により連結内皮細胞に囲まれた内腔を含んでいる。管形成はほとんどのチューブ量及び血管新生の刺激の種類に応じて2〜6時間以内に、このアッセイにおいて形成で迅速に起こる。
内皮細胞のいくつかのタイプの初代細胞および不死化細胞株14,15の両方を含むこのアッセイのために使用することができる。この記事に使用される細胞株は、マウス3B-11であったが、同じ方法論は、HUVEC（ヒト）細胞のようなSVEC4-10（マウス）のような他の内皮細胞株または初代内皮細胞と適用することができる。細胞株が使用されるかに依存し、内皮CEのかどうかLLSは、形質転換または非転換され、最適化は、適切な管形成に必要な理想的な時間を同定するために実施される必要がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
脈管形成は生理学的および病理学的プロセスの両方に関与している。血管新生に関与するメカニズムを研究することは、血管新生における主要な工程を再現アッセイの使用を必要とします。内皮細胞のチューブ形成アッセイは、他のアッセイに比べていくつかの利点を提供する。これは、アップを設定することが容易で比較的安価であり、時間内の細管を生成し、かつ定量化可能である。ま?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国立衛生研究所の国立癌研究所の学内研究プログラムによって部分的にサポートされており、NCIによってUA5CA152907を付与した。
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
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