셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서
Summary
We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.
Abstract
우리는 JPK AFM 위해, 원자 힘 현미경 (AFM)의 마이크로 / 나노 만입를 사용 식물 조직의 표면의 기계적 성질을 측정하기 위해 최근 개발 된 방법을 서술. 특히,이 프로토콜에서 우리는 꽃 분열 조직, 배축, 뿌리의 × 100 μm의 최대 100 μM의 지역에 걸쳐 세포 내 해상도에서 세포벽의 겉보기 탄성 계수를 측정한다. 이 샘플의주의 준비, 마이크로 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 단, 측정 셀 plasmolyze 따라서 세포 팽압의 기여를 제거하기 위해 만니톨의 고농도 용액으로 수행되어 세포벽 특성을 고려하여.
다른 현존하는 기술과 대조적으로, 다른 덴터 및 압입 깊이를 사용함으로써,이 방법은, 동시 다중 스케일의 측정을 허용 <em> 세포 이하의 해상도에서와 조직을 포함하는 수백 개의 셀에 걸쳐 즉. 이 때문에 공간적, 시간적으로 성장 및 분화와 상관되는 이러한 변경을 가능하게 개발 중에 셀 벽의 기계적 특성에서 일어나는 변화를 특성화하는 것이 가능하다는 것을 의미. 이 조정 미세한 세포 변화가 거시적 인 형태 발생 이벤트를 가져올 방법을 이해하는 중요한 단계를 나타냅니다.
그러나, 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다 방법은 (직경 100 μm의 정도) 만 외부 조직에 매우 작은 샘플을 사용할 수 있습니다; 이 방법은 조직의 지형에 민감하다; 그것은 조직의 복잡한 기계적 특성의 특정 측면을 측정합니다. 기술이 급속도로 개발되고 있으며 이러한 제한의 가장 가까운 미래에 해결 될 가능성이있다.
Introduction
식물의 성장은 유기체의 각각의 셀을 둘러싸 강성 세포벽 코디 팽창에 의해 달성된다. 증거를 축적하는 것은 식물이 로컬이 확장을 제어하는 세포 벽 화학의 변경을 나타냅니다. 팽창은 셀의 높은 팽압 기인 셀벽에 변형에 의해 주로 구동되는 것으로 생각된다; 팽압이 변형 응답은 셀 벽 (1)의 기계적 특성에 의해 지배된다. 약간은 이러한 기계적 특성으로 알려져 있으며, 그들이 개발하는 동안 변경하는 방법. 더욱이 작은 이러한 기계적 특성은 피드백 명백하게 조직에 걸쳐 조정되는 방식으로 셀 벽 화학을 변경할지 여부를 올릴 제어되는 방법으로 알려져있다. 우리는 화학 및 기계적 개발 중에 식물 세포벽의 변화, 그리고 궁극적으로 이러한 방법에 미세한 상호 작용을 제어하는 발전소 사이의 연결을 이해하는 경우에의 거시적 성장, 세포 또는 조직 규모로 장기를 개발하는 셀 벽의 기계적 특성을 모니터링 할 방법이 요구된다.
원자 힘 현미경 (AFM) 방법은 마이크로 미터 또는 나노 미터 티슈 압박 또는 만입 부에 기초하는, 기재, 세포 이하의 해상도에서 동시에 장기를 개발하고 조직의 전 영역에 걸쳐 세포 벽의 기계적 성질을 측정하기 위해 정밀하게 개발되었다. 다른 방법이 하나 너무 낮거나 너무 높은 해상도 : 신율은 밀리미터 규모 2-4, 초기 이벤트를 측정하기에 너무 큰 예를 들어 인 규모로 전체 조직의 평균 기계적 특성을 측정하기 만 할 수있다 기관 형성; microindenter는 나노 미터 스케일에서 세포 이하의 해상도로 측정 할 수 있지만, 고립 된 세포가 아닌 세포 또는 장기 5-7의 그룹을 측정으로 제한됩니다. AFM으로는 필요D 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도는 8 ~ 10을 달성 할 수있다. 최근 여러 프로토콜도 11, 12을 사용할 수 식물 조직의 역학을 측정하기 위해 특별히 개발되었다.
우리는 명백 영률 (13)의 측정을 통해 조직의 탄성을 평가하는 방법을 여기에 제시한다.
영 모듈러스는 일반적으로 재료의 강성을 설명하는 데 사용된다. 작은 변형 중에 재료를 변형 시키는데 필요한 힘은 압입의 면적에 비례한다. 젊은 계수이 계수이다. 연속 균질 재료의 경우에는 동일 계수에 관계없이 압입 타입 (크기 및 형상)의 측정되지만 둘레의 속도로 변화 할 것이다. 식물 조직의 복잡한 구조의 경우에, 우리는 지금까지 힘이 판단을 허용하는 변형에 비례한다는 관찰우리가 "명백한 젊은 계수"의 이름을 비례 계수. 식물의 연속 MEDIAS에서 대조적으로,이 명백한 젊은 계수는 들여 쓰기의 크기에 민감합니다. 그것은 순수 세포벽의 젊은 계수에 대응하지 않는다. 그것은 최고의 조직의 세포 벽의 발판의 신축성을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식물에서, 기계적 특성 변화는 성장 및 형태 형성을 연출에서 중요한 역할을한다. 현재까지이 식물 성장을 제어하는 유전 및 화학 네트워크를 이루는에 큰 진전되고 있지만, 이러한 네트워크에 기여하고 기계적 특성의 변화에 의해 영향을받는 방법에 대한 우리의 지식은 초보했다. 이 방법은이 공백을 채울 할 수있게해야하고, 그래서 식물의 성장이나 형태 형성의 모든 측면을 연구 과?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 많은 도움이 토론 이브 Couder에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 캔틸레버와 토론의 교정을 위해 테프 Asnacios 감사합니다. 우리는 비판적 읽기 리사 윌리스, 엘리엇 Meyerowitz, 올리버 Hamant 감사합니다. 이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0062/2005-C에 의해 부분적으로 투자되었습니다; 직원은 국립 드 라 공들인는 '' '' Growpec, ''과 '' Mechastem를 투영합니다.
Materials
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope |
| Stereo Microscopes | Leica | M125 | Any type of stereo microscopes could do. |
| 150nm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use |
| 1µm mounted cantilever | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis |
| Tipless cantiliver | nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland | TL-NCH-20 | to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver |
| 5µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Aradilte | Bartik S.A. 77170 Coubet France | Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver | |
| low melting Agarows | Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 Gelation Temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA) | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland | 951199 |
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