מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

Summary

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

אנו מתארים שיטה שפותחה לאחרונה למדידת תכונות מכאניות של פני השטח של רקמות צמח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מיקרו / ננו חריצים, לAFM JPK. באופן ספציפי, בפרוטוקול זה אנו מודדים את מודול יאנג לכאורה של קירות תא ברזולוציות subcellular על פני אזורים של עד 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר בmeristems הפרחוני, hypocotyls, ושורשים. זה דורש הכנה מדוקדקת של המדגם, הבחירה הנכונה של מיקרו indenters ועומק כניסה. כדי להסביר את דופן תא אך ורק נכסים, מדידות מתבצעות בתמיסות מרוכזות מאוד של מניטול כדי plasmolyze תאים ובכך להסיר את תרומתו של לחץ turgor התא.

בניגוד לטכניקות קיימות אחרות, באמצעות indenters שונה ועומקי כניסה, שיטה זו מאפשרת מדידות multiscale בו זמנית, <em> כלומר ברזולוציות subcellular ועל פני מאות תאים המרכיבים רקמות. משמעות הדבר היא כי ניתן כעת לאפיין מרחבית-temporally שינויים המתרחשים בתכונות מכאניות של קירות תא במהלך התפתחות, המאפשר שינויים אלה כדי להיות מתואמים עם צמיחה ובידול. זה מייצג צעד מפתח כדי להבין כיצד שינויים תאיים מיקרוסקופיים מתואמים להביא לאירועי morphogenetic מקרוסקופית.

עם זאת, מספר מגבלות יישארו: השיטה יכולה לשמש רק על דגימות קטנות למדי (כ -100 מיקרומטר קוטר) ורק ברקמות חיצוניות; השיטה היא רגישה לטופוגרפית רקמות; הוא מודד רק היבטים מסוימים של תכונות מכאניות המורכבת של הרקמות. הטכניקה מפותחת במהירות וסביר להניח כי רוב המגבלות האלה ייפתרו בעתיד הקרוב.

Introduction

צמיחה בצמחים מושגת על ידי ההרחבה מתואמת של קירות תא הנוקשה המקיפים כל תא ותא של האורגניזם. צבירת ראיות מצביעה על כך שזאת היא באמצעות השינוי של דופן תא כימיה שצמחים מקומיים לשלוט התרחבות זו. הוא חשב ההתרחבות שמונעת בעיקר על ידי לחץ על דפנות תאים, הנגרמות על ידי לחץ turgor הגבוה של התא; תגובת זן זה ללחץ turgor נשלטת על ידי התכונות מכאניות של קירות תא ^1. מעט ידוע על התכונות מכאניות הללו וכיצד הם משתנים במהלך התפתחות. יתר על כן מעט מאוד ידוע על איך התכונות מכאניות האלה נשלטות והאם פידבקים לתרום לשנות דופן תא כימיה באופן שמתואם, ככל הנראה, על פני רקמה. אם אנו רוצים להבין את הקשר בין שינויים כימיים ומכאניים בקירות תא צמח במהלך פיתוח, וסופו של דבר איך האינטראקציות מיקרוסקופיות האלה למשול צמחצמיחה מקרוסקופית של, שיטה שיכולה לפקח על תכונות מכאניות של קירות תא בפיתוח איברים בקנה המידה התאי או רקמות נדרשת.

שיטת מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) שתוארה כאן, המבוססת על לחיצות רקמת מיקרומטר או ננומטר או חריצים, פותח בדיוק כדי למדוד את התכונות מכאניות של קירות תא בפיתוח איברים בו זמנית ברזולוציות subcellular ועל פני אזורים שלמים של רקמות. יש שיטות אחרות או ברזולוציה שהיא נמוך מדי או גבוהה מדי: extensometer היא רק מסוגלת למדוד את התכונות מכאניות הממוצעת של כל רקמה בקנה מידת מילימטר ^2-4, בקנה מידה שהיא למשל גדול מדי כדי למדוד את האירועים בתחילת organogenesis; microindenter יכול לקחת מדידות ברזולוציה subcellular בקנה המידה ננומטרי, אבל זה מוגבל למדידת תאים מבודדים ולא קבוצות של תאים או איברים ^5-7. עם AFM, דורשרקמת ד, סלולרית, והחלטות subcellular יכולים להיות מושגת על ^8-10. לאחרונה כמה פרוטוקולים פותחו במיוחד כדי למדוד את המכניקה של רקמות צמחים שיכולים לשמש גם ^{11, 12.}

אנו נציג כאן כיצד להעריך את האלסטיות של הרקמות באמצעות מדידה של מודול יאנג לכאורה ^13.

מודול יאנג משמש בדרך כלל כדי לתאר את הקשיחות של חומר. במהלך עיוות קטנה את הכוח הדרוש כדי לעוות חומר הוא יחסי לאזור של כניסה. מודול יאנג הוא מקדם זה. במקרה של חומר הומוגני רציף אותו מקדם יימדד ללא קשר לסוג הכניסה (גודל וצורה), אבל ישתנה עם המהירות של המדידה. במקרה של המבנה המורכב של רקמת צמחים, ראה עד כה כי הכוח הוא פרופורציונאלי לעיוות המאפשרת הקביעהמקדם של מידתיות שאנחנו שם "מודול הצעיר לכאורה". בניגוד לכך מבמדיות מתמשכת בצמחים, מודול הצעיר לכאורה זו הוא רגיש לגודל של הכניסה. זה לא מתאימות לmoduli הצעיר של דופן תא טהורה. זה הכי טוב מתאר את האלסטיות של הפיגומים של תא הקיר של הרקמה.

Protocol

1. הכן זכוכית שקופיות להרכבה לדוגמא הכן imbedding תקשורת agarose: 0.7% agarose התכה הנמוך במניטול 10% (במים). באמצעות מכשיר מתכת חזק (טיפ לדוגמא: תרגיל, סיד), לחרוט את אזור סנטימטר 0.5 x 0.5 במרכז שקופית זכוכ?…

Representative Results

באיור 1 אנו מציגים מפות טיפוסיות יאנג moduli של meristems הפרחוני (איורים 1 א ו-1B) hypocotyls, צעיר ומבוגרת (דמויות 1C-F), וmeristem שורש (איור 1G ו1H). בכל הניסויים indenter הוא חצי כדור, אבל הרדיוס שלו שונה, כך שיכולות להיות מושגת על החלטות מרחביות שונות ?…

Discussion

בצמחים, תכונות מכאניות משתנות לשחק תפקיד מרכזי בהכוונת צמיחה והמורפוגנזה. נכון להיום חלה התקדמות רבה בהתרת הרשתות הגנטיות וכימיות השולטות בגידול צמחים, אבל הידע של איך רשתות אלה תורמות ל, ומושפע משינויים בתכונות מכאניות שלנו הוא מתוצרת מקומית. שיטה זו אמורה לאפשר לנ…

Materials

AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope
Stereo Microscopes	Leica	M125	Any type of stereo microscopes could do.
150nm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use
1µm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis
Tipless cantiliver	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	TL-NCH-20	to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver
5µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Aradilte	Bartik S.A. 77170 Coubet France		Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver
low melting Agarows	Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410	BP160-100	34-45 Gelation Temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)	M4125-500G
2  Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland	951199