La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

Summary

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

Nous décrivons une méthode récemment développée pour mesurer les propriétés mécaniques des surfaces de tissus végétaux en utilisant microscopie à force atomique (AFM) micro / nano-indentations, pour un JPK AFM. Plus précisément, dans ce protocole, nous mesurons le module de parois cellulaires de Young apparent à des résolutions sub-cellulaires à travers les régions de jusqu'à 100 um x 100 um de méristèmes floraux, hypocotyles et les racines. Cela nécessite une préparation minutieuse de l'échantillon, la sélection correcte de micro-pénétrateurs et des profondeurs d'indentation. Pour tenir compte des propriétés de la paroi cellulaire seulement, les mesures sont effectuées dans des solutions fortement concentrées de mannitol en vue de plasmolyser les cellules et ainsi supprimer la contribution de la pression de turgescence des cellules.

Contrairement à d'autres techniques existantes, en utilisant différents pénétrateurs et les profondeurs d'indentation, cette méthode permet la mesure simultanée de plusieurs échelles, <em> C'est à dire à des résolutions sub-cellulaires et sur ​​des centaines de cellules comprenant un tissu. Cela signifie qu'il est maintenant possible de caractériser spatialement-temporellement les changements qui ont lieu dans les propriétés mécaniques des parois cellulaires au cours du développement, l'activation de ces modifications pour être en corrélation avec la croissance et la différenciation. Cela représente une étape clé pour comprendre comment les changements cellulaires microscopiques coordonnées apporter sur les événements morphogénétiques macroscopiques.

Toutefois, plusieurs limitations persistent: le procédé ne peut être utilisé sur des échantillons relativement petits (autour de 100 um de diamètre) et seulement sur des tissus externes; la méthode est sensible à la topographie de tissu; il ne mesure que certains aspects des propriétés mécaniques complexes du tissu. La technique se développe rapidement et il est probable que la plupart de ces limitations seront résolus dans un proche avenir.

Introduction

La croissance des plantes est obtenue par l'expansion coordonnée des parois cellulaires rigides qui entourent chacune des cellules de l'organisme. L'accumulation de preuves indique que c'est grâce à la modification de la chimie de la paroi cellulaire des plantes qui contrôlent localement cette expansion. L'expansion est pensée pour être entraînée principalement par pression sur les parois des cellules, provoquée par la haute pression de turgescence de la cellule; cette réponse en déformation à la pression de turgescence est régie par les propriétés mécaniques des parois cellulaires ^1. On sait peu de ces propriétés mécaniques et comment ils changent au cours du développement. Par ailleurs on sait peu de la façon dont ces propriétés mécaniques sont contrôlés et si des évaluations contribuent à modifier la chimie de la paroi cellulaire d'une manière qui est apparemment coordonné à travers un tissu. Si nous voulons comprendre le lien entre les changements chimiques et mécaniques dans les parois cellulaires de la plante au cours du développement, et, finalement, comment ces interactions microscopiques régissent une planteDe croissance macroscopique, une méthode qui peut surveiller les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes à l'échelle cellulaire ou tissulaire est nécessaire.

La méthode microscopie à force atomique (AFM) décrit ici, qui est basé sur micromètre ou du nanomètre compressions de tissus ou entailles, a été développé précisément pour mesurer les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes simultanément à des résolutions sub-cellulaires et dans des régions entières du tissu. D'autres méthodes ont soit une résolution qui est trop bas ou trop élevé: l'extensomètre est seulement capable de mesurer les propriétés mécaniques moyennes d'un tissu tout à l'échelle du millimètre ^2-4, une échelle qui est par exemple trop grande pour mesurer les événements précoces l'organogenèse; la microindenter peut prendre des mesures à la résolution subcellulaire à l'échelle du nanomètre, mais il est limité à la mesure des cellules isolées et non des groupes de cellules ou d'organes ^5-7. Avec l'AFM, le besoind tissulaire, cellulaire et subcellulaire des résolutions peuvent être atteints ^8-10. Récemment, plusieurs protocoles ont été développés spécifiquement pour mesurer la mécanique de plantes tissus qui pourraient également être utilisés ^{11, 12.}

Nous allons présenter ici comment évaluer l'élasticité des tissus grâce à la mesure du module de Young apparent ^13.

Le module d'Young est couramment utilisé pour décrire la rigidité du matériau. Pendant petite déformation de la force requise pour déformer un matériau est proportionnelle à la surface de l'indentation. Le module d'Young est ce coefficient. Dans le cas d'un matériau homogène continu le même coefficient sera mesuré, indépendamment du type d'indentation (de taille et la forme) mais va changer avec la vitesse de la mesure. Dans le cas de la structure complexe de tissus végétaux, nous avons observé que la mesure de la force est proportionnelle à la déformation permettant la détermination deun coefficient de proportionnalité que l'on nomme «module de Young apparent». En contraste à partir de supports continus dans les plantes, ce module de Young apparent est sensible à la taille de l'indentation. Elle ne correspond pas à la jeune modules d'une paroi cellulaire pure. Il décrit le mieux l'élasticité de l'échafaudage de la paroi cellulaire du tissu.

Protocol

1. Préparer lames de verre pour l'échantillon de montage Préparer plongement médias agarose: 0,7% d'agarose à faible point de fusion dans 10% de mannitol (dans l'eau). L'utilisation d'un instrument de métal solide (par exemple pointe de forage, de la chaux), graver un cm x 0,5 0,5 zone dans le centre d'une lame de verre de microscope. Ou plutôt, coller un petit morceau de lamelle de verre (environ 20 x 200 um) à la lame de verre avec de la colle Araldite. REM…

Representative Results

Dans la figure 1, nous présentons des cartes de modules jeunes typiques de méristèmes floraux (Figures 1A et 1B), jeunes et vieux hypocotyles (figures 1C-F), et méristème de la racine (figure 1G et 1H). Dans toutes les expériences, le pénétrateur est hémisphérique, mais son rayon est différent de sorte que différentes résolutions spatiales peuvent être atteints figures 1C et 1D</st…

Discussion

Chez les plantes, la modification des propriétés mécaniques jouent un rôle majeur dans la direction de la croissance et de la morphogenèse. À ce jour, il ya eu de grands progrès dans le décryptage des réseaux génétiques et chimiques qui contrôlent la croissance des plantes, mais notre connaissance de la façon dont ces réseaux contribuent à et sont affectés par les changements des propriétés mécaniques est rudimentaire. Cette méthode devrait nous permettre de combler cette lacune, et il devrait donc ?…

Materials

AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample withe low topography (les then 11µm between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope
Stereo Microscopes	Leica	M125	Any type of stereo microscopes could do.
150nm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use
1µm mounted cantilever	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis
Tipless cantiliver	nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland	TL-NCH-20	to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5µm mounted cantilever. We attached a 5µm borasilicate bead to a tipless cantiliver
5µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Aradilte	Bartik S.A. 77170 Coubet France		Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver
low melting Agarows	Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410	BP160-100	34-45 Gelation Temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)	M4125-500G
2  Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland	951199