Neonatale Pial Surface Elektroporatie
Summary
De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.
Abstract
In de afgelopen jaren de pial oppervlak is geïdentificeerd als een germinal niche van belang tijdens de embryonale, perinatale en volwassen neuro-en gliogenesis, ook na een blessure. Echter, had werkwijzen voor genetisch uitlezen van deze populaties voorlopercellen en bijhouden van hun lijnen beperkt door een gebrek aan specificiteit of tijdrovend productie virussen. Zo heeft de vooruitgang in deze regio relatief traag met slechts een handvol van onderzoeken van deze plaats geweest. Elektroporatie is gebruikt voor meer dan een decennium om neurale stamcellen eigenschappen in het embryo te bestuderen, en meer recent in de postnatale hersenen. Hier beschrijven we een efficiënte, snelle en eenvoudige techniek voor de genetische manipulatie van pial oppervlak voorlopers gebaseerd op een aangepaste elektroporatie benadering. Pial oppervlak elektroporatie zorgt voor gemakkelijke genetische etikettering en manipulatie van deze voorouders, zodat aan een tijdbesparend en economische benadering voor het bestuderen van deze cellen.
Introduction
Neurale stamcellen en stamcellen aanwezig zijn in de hele zoogdier CZS 1, 2. De aard en eigenschappen van embryonale en volwassen germinal zones rond de ventriculaire gebieden van de hersenen en het ruggenmerg zijn uitgebreid gedocumenteerd in het afgelopen decennium 1-3. Voor een groot deel is dit te wijten aan de ontwikkeling van steeds precieze genetische hulpmiddelen, zoals het zenuwstelsel specifieke Cre recombinatie van floxed allelen of retrovirale lineage tracing 4. Echter, een voorouder regio-de pial oppervlak voorlopercellen zone-pas onlangs beschreven in detail 5-7 en wacht op uitgebreid onderzoek.
De pial oppervlak van de hersenen wordt gedefinieerd als de interface tussen het oppervlak van de hersenen en het omliggende hersenvliezen 8. Tijdens de ontwikkeling neuro en later radiale gliale einde voetjes aan dit oppervlak 9,10. Sommige van de sparst neuronen in de menselijke hersenen en vele neuronale mitoses waargenomen in dit gebied 11. Later, tijdens de embryonale neurogenese, corticale interneuronen waarover de pial regio doorkruisen, naast hun migratieroutes in de tussenliggende zone subventriculaire zone 12-14. Gedurende deze periode kunnen stamcellen worden gekweekt uit deze zone en het lijkt een actieve plaats van neuro-en gliogenesis 5 zijn. In de volwassen hersenen, het is gemeld dat interneuronen kunnen worden geboren uit pial oppervlak voorouders volgende hypoxische challenge 7. Echter, is de bijdrage van deze regio te zijn om genensis tijdens de embryonale en postnatale ontwikkeling duister bleef gedeeltelijk te wijten aan de moeilijkheid van specifiek onderzoek naar deze regio 6. In de colliculus superior en de cerebrale cortex kan oppervlakkige (of laag I in de cortex) interneuronen de circuituitgang onderliggende excitatoire neuron populaties moduleren en zo bijdragen significantly de functie van deze structuren. Vooral laag 1 interneuronen in uitstekende positie aan het afvuren van neuronen gehele bovenste lagen van de hersenschors gezien hun uitgebreide verbinding met de oppervlakkige en diepe lagen van de corticale kolommen 15,16 regelen. Op soortgelijke wijze, horizontale interneuronen ontvangen prikkelende input van corticale en retinale vezels, project over een relatief groot gebied en worden gespeculeerd remming van neuronale populaties reageren op externe stimuli visuele 17,18 mediëren. Ook hun morfologie is goed geschikt voor een mogelijke rol spelen in de gevormde golf activiteit in de ontwikkelende visuele systeem 19. Interessant, interneuron ontwikkeling en rijping gebeurt er met een grote mate postnataal. Verder is dit rijpingsproces gevonden door neuronale activiteit worden gereguleerd en derhalve een substraat van ontwikkelingsplasticiteit met levenslange gevolgen circuitfunctie 20,21. Met name, no promotors beschreven die specifiek kunnen richten deze cellen transgeen. Splitsen voorlopers kunnen worden gericht met retrovirus 7 maar virusproductie is tijdrovend en vereist vaardigheid om de hoge titers die nodig is voor cel transductie opleveren.
Elektroporatie heeft geleid tot een renaissance in de studie van neurologische omdat het zorgt voor een snelle en efficiënte genetische ondervraging van signaalwegen in neurale voorlopercellen 4, 22, 23. Elektroporatie omvat de injectie van plasmide-DNA, gevolgd door levering van elektrische pulsen aan de buitenkant van de kop, om het DNA in een richting rijdt de prolifererende voorlopers rond de ventrikels 4, 22, 23. Elektroporatie lijkt doorvoer van cellen vereisen door M fase van de celcyclus voor expressie van transgenen plasmide 24. Specifiek is gevonden dat slechtscellen die door M-fase binnen 8 uur van elektroporatie van plasmiden zal transgenen uiten ondanks hun effectieve levering aan alle cellen binnen ~ 160 micrometer van de ventriculaire wand 24. Er wordt gespeculeerd dat dit vanwege de noodzaak voor de afbraak van nucleaire envelop waardoor nucleaire toegang van de episomale plasmiden, chemicaliën waardoor nucleaire permeabilisatie expressie plasmiden kan induceren in plaats mitotische cellen 25. Oorspronkelijk gebruikt in het embryo 22 werd elektroporatie veel later 26, 27 aangepast voor de postnatale hersenen. Onlangs hebben we elektroporatie aangepast voor de genetische manipulatie van pial oppervlak voorlopers 6. Verder is het gebruik van deze aanpak hebben we laten zien dat er blijkbaar twee verschillende geslachten van voorouders in deze regio-Interneuronale en astrocytaire 6. Dit protocol detailleert een eenvoudige, snelle en krachtige manier om deze cellen te richten voor de ondervragingvan de mechanismen betrokken in de ontwikkeling van deze cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het meest kritische onderdeel voor een succesvolle elektroporatie van pial oppervlakte voorouders zijn: 1) het richten van plasmide mix om de pial oppervlak; 2) Het ontstaan van hematomen op de injectieplaats; en 3) het voorkomen van sterfte door middenhersenen elektroporatie.
Adequaat gericht op de pial oppervlak wordt bereikt door gemeten en zorgvuldige doorprikken van de schedel om de penetratie van de pial oppervlak te voorkomen. Onjuist richten naar de overliggende huid of onderli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de steun van de Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute Cancer Research Forum Award evenals fondsen erkennen van de Regeneratieve Geneeskunde Instituut voor Cedars-Sinai, en de Guerin Family. De beschreven project werd ondersteund in de vorm van een CTSI Core Voucher gefinancierd door het National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, en is nu in het Nationaal Centrum voor de bevordering van Translational Wetenschappen, Grant UL1TR000124. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de NIH.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neurosciences. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
