Néonatale Pial électroporation de surface
Summary
La surface piale est une zone de progéniteur unique dans le système nerveux central qui reçoit une attention croissante. Ici, nous détaillons une méthode de manipulation génétique rapide de cette zone souches en utilisant une méthode d'électroporation modifié. Cette procédure peut être utilisée pour les enquêtes cellulaires et moléculaires de lignées cellulaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation cellulaire et d'élucider le sort et les propriétés des cellules filles.
Abstract
Au cours des dernières années, la surface pial a été identifié comme un créneau germinal de l'importance au cours embryonnaire, périnatale et adulte neuro-et gliogénèse, y compris après une blessure. Cependant, les méthodes d'interrogation génétiquement ces populations de cellules progénitrices et de suivre leurs lignées ont été limitées en raison d'un manque de spécificité ou de temps de production de virus. Ainsi, les progrès réalisés dans cette région a été relativement lente avec seulement une poignée d'enquêtes de ce lieu. L'électroporation a été utilisée pour plus d'une décennie à étudier neurones propriétés de cellules souches dans l'embryon, et plus récemment dans le cerveau postnatal. Nous décrivons ici une technique efficace, rapide et simple pour la manipulation génétique des progéniteurs de surface piales fondées sur une approche d'électroporation adapté. Pial surface électroporation permet d'étiquetage génétique facile et la manipulation de ces progéniteurs, qui représente une approche gain de temps et économique pour l'étude de ces cellules.
Introduction
Cellules souches et progénitrices neurales sont présentes tout au long du mammifère CNS 1, 2. Leur nature et les propriétés dans les zones germinales embryonnaires et adultes entourant les régions ventriculaires du cerveau et de la moelle épinière ont été largement documentés dans la dernière décennie 1-3. En grande partie, cela est dû au développement d'outils génétiques de plus en plus précises, telles que le système nerveux spécifique recombinaison Cre des allèles floxé ou lignée rétroviral traçage 4. Toutefois, une région-l'ancêtre géniteur de surface pial zone-a récemment été décrite en détail 5-7 et attend examen complet.
La surface piale du cerveau est définie comme l'interface entre la surface du cerveau et des méninges entourant 8. Au cours du développement, neuro et, plus tard, radiaux gliales pieds finaux attachent à cette surface 9,10. Certains des sapinsst neurones dans le cerveau humain et de nombreux mitoses neuronales sont observés dans cette région 11. Plus tard, au cours de la neurogenèse embryonnaire, les interneurones corticaux sont connus pour traverser la région pial, en plus de leurs routes migratoires dans la zone intermédiaire et la zone sous-ventriculaire 12-14. Pendant cette période, les cellules souches peuvent être cultivées à partir de cette zone et il semble être un site actif de la neuro-et gliogénèse 5. Dans le cerveau adulte, il a été rapporté que les interneurones peuvent être nés à partir de progéniteurs de surface piales après la provocation hypoxique 7. Toutefois, la contribution de cette région à son à genensis cours du développement embryonnaire et postnatal est restée obscure en partie en raison de la difficulté d'enquêter spécifiquement cette région 6. Dans le colliculus supérieur et dans le cortex cérébral, les interneurones superficielles (couche I ou dans le cortex) peuvent moduler la sortie du circuit de populations de neurones excitateurs sous-jacentes et de contribuer ainsi significantly à la fonction de ces structures. En particulier, la couche 1 interneurones sont en position privilégiée pour réguler la décharge des neurones à travers les couches supérieures du cortex cérébral en raison de leur connectivité étendue aux couches superficielles et profondes de colonnes corticales 15,16. D'une manière similaire, les interneurones horizontales reçoivent entrée excitatrice à partir de fibres corticales et de la rétine, projet sur une zone relativement large et sont spéculé à la médiation inhibition de populations neuronales répondant aux stimuli visuels à distance 17,18. En outre, leur morphologie est bien adapté à jouer un rôle potentiel dans l'activité d'onde motifs dans le système visuel en développement 19. Fait intéressant, le développement des interneurones et la maturation se produit dans une large mesure après la naissance. En outre, ce processus de maturation a été trouvé à être réglementées par l'activité neuronale et est donc un substrat de la plasticité du développement avec des conséquences pour la vie sur la fonction de circuit 20,21. Notamment, no promoteurs sont décrits qui peuvent cibler spécifiquement ces cellules transgénique. Progéniteurs de division peuvent être ciblées avec rétrovirus 7 mais la production de virus est longue et requiert des compétences pour obtenir les titres élevés nécessaires pour la transduction cellulaire.
L'électroporation a conduit à une renaissance de l'étude de développement neurologique, car elle permet l'interrogation génétique rapide et efficace des voies de signalisation dans progéniteurs neuronaux 4, 22, 23. L'électroporation implique l'injection d'ADN de plasmide, suivie par l'envoi d'impulsions électriques à l'extérieur de la tête, à conduire de manière unidirectionnelle de l'ADN dans les progéniteurs proliférant entourant les ventricules 4, 22, 23. L'électroporation semble exiger transit à travers les cellules de la phase M du cycle cellulaire pour l'expression de transgènes plasmidiques 24. Plus précisément, il a été trouvé que seulsles cellules passant à travers l'intérieur de la phase M 8 h d'électroporation de plasmides vont exprimer des transgènes malgré une livraison efficace de toutes les cellules à l'intérieur de ~ 160 um de la paroi ventriculaire 24. On suppose que cela est dû à la nécessité d'une rupture de l'enveloppe nucléaire en permettant un accès nucléaire des plasmides épisomiques, en tant que produits chimiques provoquant la perméabilisation nucléaire peuvent induire l'expression de plasmides dans des cellules post-mitotiques 25. Oeuvre à l'origine dans l'embryon 22, l'électroporation a été adapté pour une utilisation dans le cerveau post-natal beaucoup plus tard 26, 27. Récemment, nous avons adapté électroporation pour une utilisation dans la manipulation génétique des progéniteurs de surface piales 6. En outre, en utilisant cette approche, nous avons montré qu'il existe apparemment deux lignées distinctes de progéniteurs dans cette région et astrocytaire interneuronale-6. Ce protocole détaille un moyen simple, rapide et puissant pour cibler ces cellules pour l'interrogatoirele développement de mécanismes de réglage de ces cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'aspect le plus critique pour l'électroporation réussie des progéniteurs de surface piales sont: 1) le ciblage du plasmide mélange à la surface pial; 2) en évitant la génération d'hématomes au site d'injection; et 3) en évitant la mortalité associées à l'électroporation mésencéphale.
Cibler de manière appropriée la surface pial est réalisé par perforation mesurée et soignée du crâne pour éviter la pénétration de la surface pial. Incorrecte de ci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le soutien de la recherche sur le cancer Cancer Institute Award Forum Samuel Oschin complète ainsi que des fonds de l'Institut de médecine régénérative de Cedars-Sinai, et la famille Guérin. Le projet a été financé en décrit la forme d'une base de CTSI Bon financé par le National Center for Research Resources, Grant UL1RR033176, et est maintenant au centre national pour l'avancement des sciences translationnelle, Grant UL1TR000124. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la NIH.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neurosciences. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
