Electroporation שטח pial ילודים
Summary
שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.
Abstract
בשנים האחרונות שטח pial זוהה כנישה נבטי חשיבות בנוירו וgliogenesis עובריים, לידה ומבוגר, ביניהם לאחר פציעה. עם זאת, שיטות לחקירה גנטית אוכלוסיות אב אלה ומעקב אחר השושלות שלהם היו מוגבלות בשל חוסר ספציפי או זמן רב ייצור של וירוסים. לכן, התקדמות באזור זה הייתה איטי יחסית עם רק קומץ של חקירות של מיקום זה. Electroporation שמש במשך יותר מעשור כדי ללמוד מאפיינים של תאי גזע עצביים בעובר, ולאחרונה גם במוח לאחר הלידה. כאן אנו מתארים טכניקה יעילה, מהירה, ופשוט למניפולציה הגנטית של אבות שטח pial מבוססים על גישת electroporation מותאמת. electroporation שטח pial מאפשר תיוג קליל גנטי ומניפולציה של אבות אלה, ובכך מייצג גישת חיסכון בזמן וחסכוני לחקר תאים אלה.
Introduction
תאי גזע עצביים ומצויים כעת בכל 1 במערכת העצבים המרכזית של היונקים, 2. הטבע והנכסים באזורים נבטי עובריים ובוגרים המקיפים את אזורי חדרית של המוח וחוט השדרה שלהם תועדו בהרחבה בעשור האחרון 1-3. במידה רבה, זה כבר בשל פיתוח כלים גנטיים מדויקים יותר ויותר, כגון רקומבינציה Cre הספציפית במערכת עצבים של אללים floxed או שושלת רטרווירלי התחקות 4. עם זאת,-אזור הבדיקה המקיפה-יש אזור מוליד שטח pial לאחרונה תואר רק בכל פרט 5-7 ומחכה אב אחד.
שטח pial של המוח מוגדר כממשק בין פני השטח של המוח וקרומי המוח שמסביב 8. במהלך פיתוח, neuroepithelial, ומאוחר יותר, רגליים סוף גלייה רדיאלי לצרף שטח זה 9,10. חלק מהאשוחנוירונים st במוח האנושי ורבים mitoses עצבי הם נצפו באזור זה 11. מאוחר יותר, במהלך נוירוגנזה עוברית, interneurons קליפת המוח ידוע לחצות את אזור pial, בנוסף למסלולי הנדידה שלהם באזור ביניים והאזור subventricular 12-14. במהלך תקופה זו, יכול להיות מתורבת בתאי גזע מאזור זה וזה נראה אתר פעיל של נוירו וgliogenesis 5. במוח הבוגר, זה כבר דיווח כי יכול להיוולד interneurons מאבות שטח pial הבא אתגר חוסר חמצן 7. עם זאת, תרומתו של אזור זה לו לgenensis במהלך התפתחות עוברית ואחרי הלידה נשארה מעורפלת בין שאר בשל הקושי באופן ספציפי חוקר אזור זה 6. בcolliculus מעולה ובקליפת המוח, interneurons השטחי (או ששכבה בקליפת המוח) יכול לווסת את פלט המעגל של אוכלוסיות נוירון מעוררות בסיסית ובכך לתרום significantly לפונקציה של מבנים אלה. בפרט, interneurons 1 השכבה נמצא בעמדה מעולה כדי להסדיר את הירי של נוירונים בכל השכבות העליונות של קליפת המוח ניתנה הקישוריות הנרחבת שלהם לשכבות השטחיות ועמוקות של עמודות בקליפת המוח 15,16. באופן דומה, interneurons האופקי מקבל קלט מעורר מסיבי קליפת המוח ורשתית, פרויקט על פני שטח רחב יחסית, והם העריכו לתווך עיכוב של אוכלוסיות עצביות מגיבות לגירויים חזותיים מרחוק 17,18. כמו כן, המורפולוגיה שלהם היא מתאימה היטב לתפקיד פוטנציאלי בפעילות הגלים בדוגמת במערכת הראייה מתפתחת 19. מעניין לציין, כי פיתוח interneuron והתבגרות קורה במידה רבה אחרי לידה. יתר על כן, כבר נמצא בתהליך התבגרות זה להיות מוסדר על ידי פעילות עצבית ולכן מצע של פלסטיות התפתחותית עם השלכות לכל החיים על תפקוד מעגל 20,21. יש לציין, nהיזמים o מתוארים בו באופן ספציפי יכולה למקד תאים אלה transgenically. יכולים להיות ממוקדים אבות החלוקה עם רטרווירוס 7 אבל ייצור וירוס הוא זמן רב ודורש מיומנות להניב כותרות גבוהות הנדרשות לתמרת תא.
Electroporation הוביל לתחייה בחקר התפתחות הנוירולוגית שכן היא מאפשרת לחקירה גנטית מהירה ויעילה של מסלולי איתות באבות עצביים 4, 22, 23. Electroporation כולל הזרקה של ה-DNA פלסמיד, ואחריו את המסירה של פולסים חשמליים לחלק החיצוני של הראש, לנהוג unidirectionally דנ"א לתוך תאי האב מתרבים המקיפים את חדרי הלב 4, 22, 23. Electroporation מופיע לדרוש מעבר של תאים דרך שלב M של מחזור התא לביטוי של transgenes פלסמיד 24. באופן ספציפי, זה כבר נמצא כי רקתאים עוברים שלב M בתוך 8 שעות של electroporation של פלסמידים יביעו transgenes למרות המשלוח שלהם היעיל לכל התאים בתוך ~ 160 מיקרומטר של קיר חדרי 24. ישן סברה שזה נובע מצורך בפירוק מעטפת גרעין במאפשר גישה גרעינית של פלסמידים episomal, כמו כימיקלים שגורמים permeabilization הגרעיני יכולים לגרום לביטוי של פלסמידים בתאי הודעה המיטוטי 25. מועסק במקור בעובר 22, electroporation הותאם לשימוש במוח לאחר הלידה הרבה יותר מאוחר 26, 27. לאחרונה, יש לנו להתאים electroporation לשימוש במניפולציה הגנטית של אבות שטח pial 6. יתר על כן, שימוש בגישה זו שהראינו שיש כנראה שתי שושלות שונות של אבות באזור 6-איטרניורונאליים וastrocytic זה. פרוטוקול זה מפרט את דרך פשוטה, מהירה, וחזקה כדי למקד את התאים האלה לחקירהשל פיתוח ויסות מנגנונים של תאים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההיבט הקריטי ביותר עבור electroporation המוצלח של אבות שטח pial הוא: 1) מיקוד של תערובת פלסמיד אל פני השטח pial; 2) הימנעות מהדור של שטפי דם באזור ההזרקה; ו 3) הימנעות התמותה קשורה עם electroporation המוח התיכון.
כראוי מיקוד שטח pial מושגת על ידי ניקוב מדו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות תמיכה מחקר סרטן מכון סרטן פורום פרס סמואל Oschin המקיף, כמו גם כספים מהמוסד לרפואת רגנרטיבית של Cedars-Sinai, ומשפחת גרן. הפרויקט המתואר נתמכה בצורה של Core שובר CTSI מומן על ידי המרכז הלאומי לחקר משאבים, גרנט UL1RR033176, והיום הוא במרכז הלאומי לקידום מדעי Translational, גרנט UL1TR000124. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIH.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neurosciences. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
