新生児軟膜表面エレクトロ
Summary
軟膜表面はますます注目を受けているCNSにおけるユニークな前駆ゾーンです。ここで、我々の詳細を修飾エレクトロポレーション法を使用して、この前駆ゾーンの迅速な遺伝子操作のための方法。この手順は、細胞系統および細胞分化に関与するシグナル伝達経路の細胞および分子研究のために使用することができ、娘細胞の運命および特性を解明する。
Abstract
過去数年間で軟膜表面は損傷後を含め、胚周産期および成人の神経およびグリア発生時の重要性の胚ニッチとして同定されている。しかしながら、これらの遺伝的に前駆細胞集団に問い合わせ、それらの系統を追跡するための方法は、特異性またはウイルスの産生時間を消費がないため限定されていた。したがって、この領域での進歩はこの場所の調査のほんの一握りでは比較的遅れている。エレクトロポレーションは、胚の神経幹細胞の特性を研究し、より最近では生後脳におけるする十年間使用されている。ここでは、適合したエレクトロポレーション法に基づく軟膜表面前駆細胞の遺伝子操作のための、効率的で迅速な、かつ簡単な手法について説明します。軟膜表面エレクトロポレーションは、このようにこれらの細胞を研究するための時間の節約で経済的なアプローチを表す、これらの前駆細胞の容易な遺伝標識及び操作を可能にする。
Introduction
神経幹細胞および前駆細胞は、哺乳動物CNS 1、2を通して存在している。その性質や脳と脊髄の心室領域を取り巻く胚および成体胚ゾーンの特性は、広範囲過去十年間1-3に記載されています。大部分は、これは、このようなフロックス対立遺伝子または4をトレースするレトロウイルス系統の神経系の特定のCre組換えとしてますます正確な遺伝的なツールの開発になっている。しかし、1前駆地域軟膜表面前駆ゾーンは、しているのはごく最近では詳細5-7に説明され、総合的な検討を待ってさ。
脳の軟膜表面は、脳の表面と周囲の髄膜8との間のインタフェースとして定義される。後の開発、神経上皮と、中は、放射状グリアエンドフィートは、この表面9,10に接続します。モミの一部人間の脳およびニューロンの多くの有糸分裂における番目のニューロンは、この領域11において観察される。その後、胚の神経発生の間に、皮質ニューロンは、中間ゾーンおよび脳室下帯12-14におけるそれらの遊走の経路に加えて、軟膜領域を横断することが知られている。この期間中に、幹細胞は、このゾーンから培養することができる、それは神経およびグリア5の活性部位であると思われる。成体の脳において、介在ニューロンは、低酸素チャレンジ7以下の軟膜表面前駆細胞から生まれることができることが報告されている。しかし、胚および生後発育中にgenensisに彼に、この領域の寄与は、特にこの領域6を調査することの困難に一部あいまいなままである。上丘におよび大脳皮質において、表面的な（または皮質の層I）介在ニューロンは、下にある興奮性ニューロン集団の回路出力を変調するため、significを貢献するかもしれないこれらの構造の機能にantly。具体的には、レイヤ1介在ニューロンは、皮質の列15,16の表層と深層に彼らの広範な接続性与えられた大脳皮質の上位層を通してニューロンの発火を調整するために主要な位置にある。同様に、水平ニューロンは、比較的広い面積にわたって皮質および網膜繊維、プロジェクトから興奮性入力を受信し、遠隔視覚刺激17,18に応答ニューロン集団の阻害を媒介すると推測される。また、その形態は現像視覚系19におけるパターン化された波の活動に潜在的な役割を果たしてよく適している。興味深いことに、ニューロンの発達と成熟は、出生後大幅に起こります。また、この成熟過程は、神経活動によって調節されることが見出されているので、回路機能20,21上の生涯結果を伴う発達可塑性の基板である。注目すべきことに、NOプロモーターは、特にトランスジェニックこれらの細胞を標的とすることができるが記載されている。除する前駆細胞は、レトロウイルス7でターゲティングすることができるが、ウイルス産生は時間がかかり、細胞形質導入のために必要な高い力価を得るために熟練を要する。
それが神経前駆細胞4、22、23におけるシグナル伝達経路の迅速かつ効率的な遺伝的尋問を可能にするので、エレクトロポレーションは、神経発達の研究でルネサンスにつながっている。エレクトロポレーションは、一方向4脳室の周囲の増殖性前駆細胞にDNAを駆動するために、ヘッドの外部への電気パルスの送出に続いて、プラスミドDNAの注入を伴う22、23。エレクトロポレーションは、プラスミドの導入遺伝子24の発現のために細胞周期のM期を通過する細胞の通過を必要とするように見える。具体的には、それだけであることが見出されているプラスミドのエレクトロポレーションの8時間以内にM期を通過する細胞は、心室壁24の〜160ミクロン内の全ての細胞への効果的な配信にもかかわらず、導入遺伝子を発現する。これは、核透過性を引き起こす化学物質が有糸分裂後の細胞25内のプラスミドの発現を誘導することができるように、これは、エピソームプラスミドの核へのアクセスを可能に核膜破壊の必要性によるものであると推測される。もともと胚22で用い、エレクトロポレーションは、ずっと後26,27生後脳内での使用に適合した。最近では、軟膜表面前駆6の遺伝子操作で使用するためのエレクトロポレーションを適応している。また、このアプローチを使用して我々は、前駆体の二つの異なる系統がこの領域-介在ニューロンおよびアストロサイト6に明らかに存在することが示されている。このプロトコルは、尋問のためにこれらの細胞を標的とするために簡単、迅速、かつ強力な方法を詳述これらの細胞の発達を調節する機構の。
Protocol
Representative Results
Discussion
軟膜表面前駆細胞の正常なエレクトロポレーションのための最も重要な側面は、次のとおりです。1）軟膜表面にプラスミドミックスの標的; 2）注射部位における血腫の発生を回避すること;および3）中脳電気穿孔に関連した死亡率を回避する。
適切に標的化は、軟膜表面は軟膜表面の浸透を避けるために、頭蓋骨の測定と慎重なパンクチャリングすることによって達成?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ヒマラヤスギシナイの再生医療研究所、ゲラン家族からサミュエルOschin総合がん研究所がん研究フォーラム賞からのサポートだけでなく、資金を承認したいと思います。記載されたプロジェクトは、研究資源、グラントUL1RR033176国立センターによって資金を供給CTSIコアバウチャーの形でサポートされ、トランスレーショナル科学、グラントUL1TR000124を進めるためのナショナルセンターで今した。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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