Неонатальный пиальных поверхности Электропорацию
Summary
Пиальных поверхности зона является уникальной предшественников в ЦНС, что уделяется все большее внимание. При этом мы подробно способ быстрого генетической манипуляции этой зоны предшественников с использованием модифицированного метода электропорации. Эта процедура может быть использована для клеточных и молекулярных исследований клеточных линий и сигнальных путей, участвующих в дифференцировке клеток и выяснить судьбу и свойства дочерние клетки.
Abstract
За последние несколько лет пиальных поверхность была определена в качестве зародышевого нише значение во время эмбрионального, перинатальной и взрослых нейро-и глиогенеза, в том числе после травмы. Тем не менее, методы генетически допрашивать этих групп населения предшественников и отслеживания их клоны были ограничены из-за отсутствия специфичности или времени производство вирусов. Таким образом, прогресс в этой области был довольно медленным только с горсткой исследований этого месте. Электропорация была использована уже более десяти лет, чтобы изучить нервные свойства стволовых клеток в эмбрион, а в последнее время в послеродовом мозга. Здесь мы опишем эффективную, быструю и простую технику для генетических манипуляций пиальных поверхностных предшественников на основе адаптированной для электропорации подхода. Пиальных поверхность электропорации позволяет легкому генетической маркировки и манипуляции этих предшественников, тем самым представляя экономия времени и экономичный подход к изучению этих клеток.
Introduction
Нервные стволовые и клетки-предшественники присутствуют в ЦНС млекопитающих 1, 2. Их природа и свойства в эмбриональных и взрослых зародышевых зонах, окружающих желудочковой области мозга и спинного мозга были хорошо документированы в последнее десятилетие 1-3. В значительной степени это было связано с развитием более точных генетических инструментов, таких как нервная система конкретного Cre рекомбинации floxed аллелей или ретровирусов линии трассировки 4. Тем не менее, один регион-прародитель относящийся к мягкой мозговой оболочке поверхность предшественников зона-недавно был описан только в деталях 5-7 и ждет комплексное обследование.
Пиальных поверхность мозга определяется как интерфейс между поверхностью мозга и окружающих мозговых оболочек 8. Во время развития нейроэпителиальные, а позднее, радиальные глиальные конечные футов приложить к этой поверхности 9,10. Некоторые из пихтыул нейроны в мозге человека и многих нейронных митозов наблюдаются в этом регионе 11. Позже, во время эмбрионального нейрогенеза, корковых интернейронов, как известно, пройти пиальных регион, в дополнение к их миграционных путей в промежуточной зоне и субвентрикулярной зоне 12-14. В течение этого периода, стволовые клетки можно культивировать из этой зоны, и это, кажется, активный центр нейро-и глиогенеза 5. Во взрослом мозге, было сообщено, что интернейроны может родиться от пиальных поверхностных предшественников следующее гипоксического вызов 7. Тем не менее, вклад этой области, чтобы его в genensis во время эмбрионального и постнатального развития остается неясным, в частности в связи с трудностью специально расследование этого региона 6. В верхний бугорок и в коре головного мозга, поверхностные (или слой I в коре) интернейроны может модулировать схему вывода основных возбуждающих популяций нейронов и тем самым способствовать significantly к функции этих структур. В частности, слой 1 интернейроны находятся в позиции, чтобы регулировать возбуждения нейронов на протяжении верхних слоях коры головного мозга с учетом их Широкие возможности подключения к поверхностных и глубоких слоев коры колонн 15,16. Аналогичным образом, горизонтальные интернейронов возбуждающих получать ввод от коры и сетчатки волокон, проекта в относительно широком области и предположили, посредником ингибирование нейрональных популяций, ответивших на удаленном зрительных стимулов 17,18. Кроме того, их морфология хорошо подходит играть потенциальную роль в узорной волновой активности в развивающихся зрительной системы 19. Интересно, что развитие интернейронов и созревание происходит в значительной степени после рождения. Кроме того, этот процесс созревания было установлено, регулируется нейронной активности и, следовательно, субстрат пластичности развития с пожизненных последствий для функции схемы 20,21. Примечательно, что пO промоторы описаны который может специфически нацелены эти клетки трансгенно. Разделительные предшественники могут быть направлены с ретровируса 7, но производство вируса занимает много времени и требует навыков, получая высокие титры клеток, необходимых для трансдукции.
Электропорацию привело к возрождению в изучении нервной системы, так как позволяет для быстрого и эффективного генетического допроса сигнальных путей в нейронных клеток-предшественников 4, 22, 23. Электропорации включает инъекции плазмидной ДНК, после чего доставки электрических импульсов к внешней части головы, в одном направлении приведения в действие ДНК в пролиферирующих клеток-предшественников, окружающих желудочки 4, 22, 23. Электропорации, как представляется, требуют транзит через клеток М-фазе клеточного цикла для экспрессии трансгенов плазмидных 24. В частности, было обнаружено, что толькоклетки, проходящие через M фазы в 8 часов электропорации плазмид выразит трансгены, несмотря на их эффективной доставки всех клеток в ~ 160 мкм желудочковой стенки 24. Он предположил, что это связано с необходимостью срыва ядерной оболочки в разрешении ядерной доступа из эписомные плазмид, как химические вещества, вызывающие ядерной пермеабилизации может индуцировать экспрессию плазмид в пост митотических клеток 25. Первоначально использовали в эмбрионе 22, электропорацию был адаптирован для использования в послеродовом мозга гораздо позже 26, 27. В последнее время мы приспособились электропорации для использования в генетических манипуляций пиальных поверхностных предшественников 6. Кроме того, с помощью этого подхода мы показали, что там, по-видимому два различных происхождений предшественников в этой области-межнейронной и астроцитов 6. Этот протокол детали простой, быстрый, и мощный способ предназначаться эти клетки для допросаразвития механизмов, регулирующих этих клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Самый важный аспект для успешного электропорации пиальных поверхностных предшественников являются: 1) адресности плазмиды смеси, чтобы пиальных поверхности; 2) предотвращение генерацию гематом в месте инъекции; и 3) избежать смертности, связанных с среднего мозга электропорации.
<p cla…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность поддержки со стороны Самуэль Ошина всеобъемлющем институт рака онкологического научного форума премии, а также средства от регенеративной медицины Института Cedars-Sinai, и Герена семьи. Проект описывается была поддержана в виде CTSI Основной ваучером, финансируемого Национальным центром исследований ресурсов, Грант UL1RR033176, и в настоящее время в Национальном центре для продвижения поступательного науки, Грант UL1TR000124. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
References
- Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. Neural stem cells: historical perspective and future prospects. Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), (2000).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn’t gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
- Breunig, J. J., et al. Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation. Neural Dev. 7, (2012).
- Ohira, K., et al. Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells. Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).
- Schmechel, D. E., Rakic, P. A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes. Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).
- Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis. J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).
- Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. The first neurons of the human cerebral cortex. Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).
- Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex. Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).
- Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex. J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).
- Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone. J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).
- Larkum, M. E. The yin and yang of cortical layer 1. Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).
- Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. The organization of two new cortical interneuronal circuits. Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).
- Endo, T., Isa, T. Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus. Neurosciences. 108 (1), 129-141 (2001).
- Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors. J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).
- Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Boller, M., Schmidt, M. Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus. Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).
- De la Rossa, A., et al. In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons. Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PLoS One. 3 (4), (2008).
- Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PLoS One. 3 (1), (2008).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat Commun. 3, (2012).
- Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).
- Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J Vis Exp. , (2013).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore. PLoS One. 6 (12), (2011).
