Neonatal electroporación superficie pial
Summary
La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las células hijas.
Abstract
En los últimos años la superficie pial ha sido identificado como un nicho germinal de importancia durante embrionario, perinatal y adultos neuro-y gliogénesis, incluyendo después de la lesión. Sin embargo, los métodos para interrogar genéticamente estas poblaciones progenitoras y el seguimiento de sus linajes habían sido limitadas debido a la falta de especificidad o mucho tiempo la producción de virus. Por lo tanto, el progreso en esta región ha sido relativamente lento con sólo un puñado de investigaciones de esta ubicación. La electroporación se ha utilizado durante más de una década para estudiar las propiedades de células madre neurales en el embrión, y más recientemente en el cerebro postnatal. Aquí se describe una técnica eficiente, rápido, y sencillo para la manipulación genética de los progenitores superficie pial basadas en un enfoque adaptado electroporación. Pial electroporación superficie permite el etiquetado genética fácil y manipulación de estos progenitores, lo que representa un enfoque de ahorro de tiempo y económico para el estudio de estas células.
Introduction
Células madre y progenitoras neurales están presentes en todo el SNC de mamíferos 1, 2. Su naturaleza y propiedades en zonas germinales embrionarias y adultas que rodean las regiones ventriculares del cerebro y la médula espinal han sido ampliamente documentados en la década pasada 1-3. En gran parte, esto se ha debido al desarrollo de herramientas genéticas cada vez más precisas, como el sistema nervioso específico recombinación Cre de alelos floxed o linaje retroviral trazando 4. Sin embargo, una región-el progenitor pial progenitor superficie de la zona-sólo recientemente ha sido descrito en detalle 5-7 y espera examen exhaustivo.
La superficie de la pía madre del cerebro se define como la interfaz entre la superficie del cerebro y las meninges que rodean 8. Durante el desarrollo, neuroepitelial y, más tarde, radiales pies terminales gliales se adhieren a esta superficie de 9,10. Algunos de los abetosst neuronas en el cerebro humano y muchas mitosis neuronales se observan en esta región 11. Más tarde, durante la neurogénesis embrionario, las interneuronas corticales son conocidos para atravesar la región de la pía madre, además de sus rutas migratorias en la zona intermedia y la zona subventricular 12-14. Durante este período, las células madre pueden ser cultivadas a partir de esta zona y que parece ser un centro activo de la neuro-y gliogenesis 5. En el cerebro adulto, se ha informado de que las interneuronas pueden nacer de progenitores superficie pial siguiente desafío hipóxico 7. Sin embargo, la contribución de esta región a su a genensis durante el desarrollo embrionario y posnatal ha permanecido en la oscuridad, en parte debido a la dificultad de investigar específicamente esta región 6. En el colículo superior y en la corteza cerebral, interneuronas superficiales (o capa I en la corteza) pueden modular la salida del circuito de poblaciones de neuronas excitatorias subyacentes y por lo tanto contribuir cantidaantly a la función de estas estructuras. En particular, la capa 1 interneuronas están en una posición privilegiada para regular la descarga de las neuronas a través de las capas superiores de la corteza cerebral, dada su amplia conectividad a las capas superficiales y profundas de las columnas corticales 15,16. En una manera similar, las interneuronas horizontales reciben excitatorios de entrada a partir de fibras corticales y retinales, proyecto sobre un área relativamente amplia y se especula para mediar en la inhibición de las poblaciones neuronales que responden a estímulos visual remota 17,18. Además, su morfología es muy adecuado para jugar un papel potencial en la actividad de las ondas con dibujos en el desarrollo del sistema visual 19. Curiosamente, el desarrollo de las interneuronas y maduración ocurre en gran medida después del nacimiento. Además, este proceso de maduración se ha encontrado para ser regulada por la actividad neuronal y por lo tanto es un sustrato de la plasticidad del desarrollo con consecuencias de por vida sobre la función del circuito 20,21. Notablemente, No Los promotores se describen que pueden dirigirse específicamente a estas células transgénica. La división de progenitores pueden ser dirigidos con retrovirus 7, pero la producción de virus es mucho tiempo y requiere habilidad para producir los altos títulos necesarios para la transducción de células.
La electroporación ha llevado a un renacimiento en el estudio de desarrollo neurológico, ya que permite la interrogación genético rápido y eficiente de las vías de señalización de los progenitores neurales 4, 22, 23. La electroporación implica la inyección de ADN plásmido, seguido de la entrega de pulsos eléctricos a la parte exterior de la cabeza, para conducir unidireccionalmente el ADN en los progenitores proliferantes que rodean los ventrículos 4, 22, 23. La electroporación parece requerir el tránsito de células a través de la fase M del ciclo celular para la expresión de los transgenes plásmido 24. Específicamente, se ha encontrado que sólocélulas que pasan a través de la fase M dentro de 8 horas de la electroporación de plásmidos expresarán transgenes a pesar de su entrega efectiva a todas las células dentro de ~ 160 m de la pared ventricular 24. Se especula que esto se debe a la necesidad de la envoltura nuclear desglose en que permite un acceso nucleares de los plásmidos episomales, como los productos químicos que causan la permeabilización nuclear puede inducir la expresión de los plásmidos en las células mitóticas poste 25. Originalmente empleado en el embrión 22, electroporación se adaptó para su uso en el cerebro postnatal mucho más tarde 26, 27. Recientemente, hemos adaptado la electroporación para su uso en la manipulación genética de los progenitores superficie pial 6. Además, usando este enfoque, hemos demostrado que hay aparentemente dos linajes distintos de los progenitores en esta región-interneuronal y astrocítico 6. Este protocolo detalla una manera simple, rápida y potente para atacar estas células durante el interrogatorioel desarrollo de mecanismos de regulación de estas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aspecto más crítico para la electroporación éxito de progenitores superficie pial son: 1) la orientación de la mezcla de plásmido a la superficie de la pía madre; 2) evitando la generación de hematomas en el lugar de la inyección; y 3) evitar la mortalidad asociada con la electroporación mesencéfalo.
Apropiadamente la orientación de la superficie de la pía madre se lleva a cabo por punción medido y cuidadoso del cráneo para evitar la penetración de la superficie de la pía…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el apoyo del Instituto del Cáncer Cancer Research Award Samuel Oschin Integral Foro, así como los fondos del Instituto de Medicina Regenerativa de Cedars-Sinai, y la familia de Guerin. El proyecto que se describe fue apoyado en la forma de un CTSI Core Vale financiado por el Centro Nacional de Recursos para investigación, Grant UL1RR033176, y ahora está en el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, de Grant UL1TR000124. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.
Materials
| Item Name | Vendor | Catalog Number |
| Fire Polished Borosilicate Tubing | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments Company | P-30 |
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, Inc. | F7528 |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments Company | |
| ECM 830 Generator | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0052 |
| 3mm Platinum Tweezertrodes | Harvard Apparatus, BTX Instrument Div | 45-0487 |
| SignaGel Electrode Gel | Cardinal Health | 70315-025 |
| Tris-EDTA Buffer, pH 8.0 | Integrated DNA Technologies, Inc. | 11-01-02-05 |
| Infrared Heat Lamp | VWR | 36547-009 |
| Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 |
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