Neonatal Pial Surface Elektroporering

Summary

Den pial ytan är en unik stamfader zon i CNS som får allt större uppmärksamhet. Häri vi detalj en metod för snabb genetisk manipulering av denna progenitor zonen med användning av en modifierad elektroporeringsmetoden. Detta förfarande kan användas för cellulära och molekylära undersökningar av cell linjer och signaleringsvägar involverade i cell-differentiering och för att belysa vad som händer och egenskaperna av dotterceller.

Abstract

Under de senaste åren pial ytan har identifierats som en germinal nisch av betydelse under foster, perinatal och vuxen neuro-och gliogenesis, även efter skada. Men metoder för genetiskt förhöra dessa progenitorceller populationer och spåra deras härstamningar hade begränsats på grund av brist på specificitet eller tidskrävande produktion av virus. Således har framstegen på detta område varit relativt långsam med bara en handfull undersökningar av denna plats. Elektroporation har använts i över ett decennium för att studera neurala stamceller fastigheter i embryot, och mer nyligen i postnatal hjärnan. Här beskriver vi en effektiv, snabb och enkel teknik för genetisk manipulation av pial ytan progenitorer som baseras på ett anpassat elektroporering tillvägagångssätt. Pial yta elektroporering möjliggör facile genetisk märkning och hantering av dessa föregångare, vilket motsvarar en tidsbesparande och ekonomisk metod för att studera dessa celler.

Introduction

Neurala stamceller och stamfaderceller är närvarande i hela CNS hos däggdjur ^{1, 2.} Deras natur och egenskaper i embryonala och vuxna embryon zoner kring kammar regioner i hjärnan och ryggmärgen har utförligt dokumenterat i det senaste decenniet ^1-3. Till stor del har detta berott på utvecklingen av mer exakta genetiska verktyg, såsom nervsystemet specifik Cre rekombination av floxed alleler eller retroviral lineage tracing ^4. Men en stamfader region-pial ytan gångare zon-har nyligen beskrivits i detalj ^5-7 och väntar omfattande undersökning.

Pial hjärnans yta definieras som gränsytan mellan ytan av hjärnan och de omgivande hjärnhinnorna ^8. Under utveckling, neuroepiteliala och, senare, radiella gliaceller slut fötter fäster denna yta ^9,10. En del av granst nervceller i den mänskliga hjärnan och många neuronala mitoser observeras i denna region ^11. Senare, under foster neurogenes, är kortikala intern kända för att korsa pial regionen, utöver sina flyttvägar i mellanzonen och subventrikulära zonen ^12-14. Under denna period kan stamceller odlas från denna zon och det verkar vara ett aktivt ställe av neuro-och gliogenesis ^5. I den vuxna hjärnan, har det rapporterats att intern kan födas från pial ytan stamceller efter hypoxisk utmaning ^7. Däremot har bidrag i denna region till hans att genensis under foster-och postnatal utveckling var fortsatt oklar delvis på grund av svårigheten att specifikt utreda denna region ^6. I den överlägsna colliculi och i hjärnbarken, kan ytliga (eller skikt I i cortex) intern modulera utgångskretsen underliggande excitatoriska neuronpopulationer och därmed bidra signifikantaoch art till funktionen hos dessa strukturer. Särskilt lager 1 interneuronen är i utmärkt läge för att reglera bränning av nervceller under de övre lagren av hjärnbarken med tanke på deras omfattande anslutningsmöjligheter till de ytliga och djupa lager av bark-kolonner ^15,16. På ett liknande sätt, horisontella interneuronen får excitatoriska input från kortikala och retinala fibrer, projekt över ett relativt stort område och spekulerade att förmedla hämning av neuronala populationer svarar på fjärr visuella stimuli ^17,18. Dessutom är deras morfologi väl lämpad för att spela en potentiell roll i den mönstrade våg aktivitet i framkallnings synsystemet ^19. Interestingly interneuron utveckling och mognad sker i stor utsträckning postnatalt. Vidare har denna mognadsprocess visat att regleras av nervaktivitet och är därför ett substrat av utvecklings plasticitet med livslånga konsekvenser för kretsfunktion ^20,21. Notably, no tagare beskrivs som specifikt kan rikta dessa celler transgent. Delnings progenitorer kan riktas med retrovirus ⁷ men virusproduktionen är tidskrävande och kräver skicklighet för att ge de höga titrar som behövs för cellöverföring.

Elektroporation har lett till en renässans i studiet av nervsystemets utveckling eftersom det möjliggör snabb och effektiv genetisk förhör av signalvägar i neurala stamceller ^{4, 22, 23.} Elektroporation innebär injektion av plasmid-DNA, följt av avgivning av elektriska pulser till utsidan av huvudet, att ensriktat driva DNA i de prolifererande ursprungsceller som omger kamrarna ^{4, 22, 23.} Elektroporation verkar kräva transitering av celler genom M-fasen av cellcykeln för expression av plasmid-transgener ^24. Specifikt har man funnit att endastceller som passerar genom M fas inom 8 timmar av elektroporering av plasmider kommer att uttrycka transgener trots deras effektiva leveranser till alla celler i ~ 160 nm av kammarväggen ^24. Det spekuleras i att detta beror på behovet av kärnhöljet uppdelning i att låta för nukleär åtkomst av de episomala plasmider, såsom kemikalier som orsakar nukleär permeabilization kan inducera expression av plasmidema i post mitotiska celler ^25. Ursprungligen användes i embryot ²² ades elektroporering anpassad för användning i den postnatala hjärnan mycket senare ^{26, 27.} Nyligen har vi anpassat elektroporation för användning i genetisk manipulation av pial yta gångare ^6. Vidare, genom att använda denna metod har vi visat att det finns uppenbarligen två olika linjerna av progenitorer i denna region-interneuronal och astrocytisk ^6. Detta protokoll detaljer en enkel, snabb, och kraftfullt sätt att rikta dessa celler för det undersökandeav de mekanismer som styr utvecklingen av dessa celler.

Protocol

Detta förfarande är i enlighet med Cedars-Sinai IACUC krav. Utredarna ska säkerställa institutionell IACUC efterlevnad innan du fortsätter. Alla verktyg och reagenser skall steriliseras före användning. 1. Beredning av verktyg, lösningar, och DNA-blandning Sätt i 100-mm brand polerat borosilikatglas kapillärrör i en mikropipett avdragare. Ställ uppvärmning för att möjliggöra vanlig viktade pull att bilda pipettspetsen på ca 17,5 mm. Skär tips med vassa kirurgiska…

Representative Results

Pial ytan elektroporation resulterar i expression av plasmid-DNA i celler-mestadels progenitorer-vid eller nära den pial ytan 6. Mer specifikt är den orientering av elektrod kritisk i att diktera riktningen av plasmid rörelse och efterföljande expression. Således, i dubbla elektrodkonfigurationer är plasmiden riktad leden rakt vektor mellan den negativa och positiva elektroden. Därför, om den negativa polen placeras över injektionsstället och den positiva polen är ventrala till den negativa polen, …

Discussion

Den mest kritiska aspekten för framgångsrik elektroporation av pial yta gångare är: 1) inriktning av plasmiden mix till pial ytan; 2) undvika alstringen av hematom vid injektionsstället; och 3) att undvika dödlighet i samband med mitthjärnan elektroporation.

Lämpligt riktar pial ytan sker genom uppmätt och noggrann punktering av skallen för att undvika penetration av pial ytan. Felaktig inriktning för att den överliggande huden eller underliggande ventrikel eller hjärnparenkymet…

Materials

Item Name	Vendor	Catalog Number
Fire Polished Borosilicate Tubing	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
Micropipette Puller	Sutter Instruments Company	P-30
Fast Green FCF	Sigma Aldrich, Inc.	F7528
XenoWorks Digital Microinjector	Sutter Instruments Company
ECM 830 Generator	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0052
3mm Platinum Tweezertrodes	Harvard Apparatus, BTX Instrument Div	45-0487
SignaGel Electrode Gel	Cardinal Health	70315-025
Tris-EDTA Buffer, pH 8.0	Integrated DNA Technologies, Inc.	11-01-02-05
Infrared Heat Lamp	VWR	36547-009
Fine Scissors Sharp	Fine Science Tools	14060-09