Method Article

Préparation de l'ADN réticulé polyacrylamide hydrogels

DOI:

10.3791/51323

⸱

August 27th, 2014

 , 
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Notre laboratoire a développé des hydrogels de polyacrylamide ADN réticulé, un système d'hydrogel dynamique, afin de mieux comprendre les effets de la modulation de la rigidité des tissus sur la fonction cellulaire. Ici, nous fournissons des schémas, des descriptions et des protocoles pour préparer ces hydrogels.

Abstract

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Mécanobiologie est un domaine scientifique émergent qui porte sur le rôle critique de repères physiques dans la direction de la morphologie et de la fonction des cellules. Par exemple, l'effet de l'élasticité des tissus sur la fonction cellulaire est un domaine de recherche important de mécanobiologie car la rigidité des tissus module à la maladie, le développement, et les blessures. Statique des matériaux de tissus imitant ou des matériaux qui ne peuvent pas modifier la rigidité fois que les cellules sont étalées, sont principalement utilisés pour étudier les effets de la rigidité des tissus sur les fonctions cellulaires. Bien que les informations recueillies à partir d'études statiques est précieux, ces études ne sont pas représentatifs de la nature dynamique du microenvironnement cellulaire in vivo. Pour mieux cerner les effets de la rigidité dynamique sur la fonction cellulaire, nous avons développé un système hydrogel de polyacrylamide ADN réticulé (gels d'ADN). Contrairement à d'autres substrats dynamiques, des gels d'ADN sont capables de diminuer ou d'augmenter la rigidité après la fabrication sans stimuli. les gels sont constitués d'ADN de l'ADN crossldes encres qui sont polymérisés dans un squelette de polyacrylamide. Ajout et suppression de liaisons transversales par délivrance d'ADN simple brin permet temporelle, spatiale, et le contrôle réversible de gel élasticité. Nous avons montré que dans les rapports précédents modulation dynamique de gel d'ADN élasticité influe sur le comportement des fibroblastes et des neurones. Dans le présent rapport et la vidéo, nous fournissons un schéma qui décrit le gel d'ADN mécanismes de réticulation et des instructions étape-par-étape sur les gels d'ADN de préparation.

Introduction

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Substrats statiques et dynamiques sont deux catégories de biomatériaux qui ont été développés pour étudier les effets de l'élasticité des tissus ou de la rigidité sur la fonction cellulaire. Substrats statiques sont incapables de modifier leurs propriétés physiques après ils sont fabriqués et / ou une fois les cellules sont étalées. Polyacrylamide (PA) ont été les premiers gels, des substrats statiques à deux dimensions qui ont été synthétisés pour les enquêtes sur mécanobiologie 5,17. Gels PA sont faciles à préparer, peu coûteux, polyvalent, et peuvent être fabriqués avec une large gamme de modules d'élasticité. Bien que ces avantages techniques font PA g....

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Protocol

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NOTE: Le protocole de l'ensemble de préparation d'un gel de traitement de cellule prend un minimum de six jours. Temps estimé pour la préparation de gel est de 8 heures, plus un O / N incubation. Estimation du temps d'immobilisation de gel et l'ADN recuit est 8 heures, plus une étape O / N rinçage. Temps estimé pour gel fonctionnalisation est de 2 h. Durée de placage et la croissance cellulaire est dépendante du type de culture et à l'application, mais un minimum de quatre jours est nécessaire.

1 Préparation de gels d'ADN

NOTE: Préparer les gels d'ADN en trois étapes distinctes. Tout ....

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Results

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Avant nos études, les interactions cellule-ECM ont été observés sur les biomatériaux conformes statiques ou dynamiques sur des substrats irréversibles et unidirectionnels. Ces substrats ne reflètent pas fidèlement la nature dynamique du microenvironnement cellulaire. Notre travail déplace les paradigmes techniques existantes en fournissant un modèle plus physiologique pour étudier les interactions cellule-ECM sur le ramollissement et de renforcement des biomatériaux dynamiques. Dans des études précédentes, nous avons an.......

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Discussion

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La capacité de gels d'ADN pour adoucir ou raidir avant et après l'adhésion cellulaire en fait un modèle idéal pour étudier le rôle de la raideur dynamique en fonction du tissu cellulaire. Ces trois modèles ont été utilisés dans les études biologiques et mécaniques. Toutefois, les trois modèles ont des élasticités semblables à différents pourcentages de réticulation, indiquant la longueur de réticulation n'influence pas l'élasticité de gel d'ADN (tableau 2). En revanche, la concentrat.......

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Disclosures

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Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier: Dr Frank Jiang, le Dr David Lin, le Dr Bernard Yurke et le Dr Uday Chippada pour leurs contributions sur le développement de la technologie d'ADN sur gel; Dr Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter pour leurs commentaires et modifications de ce manuscrit; sources de financement, y compris la Commission du New Jersey sur la moelle épinière de la recherche (subvention no 07A-019-SCR1, NAL) et du New Jersey Institut des Neurosciences (MLP); et les éditeurs de génie tissulaire, la partie A pour obtenir la permission de réimprimer les figures 2 et 4 et des biomaté....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ssDNAIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		Ne vortex pas d’ADNsb. Retournez doucement la solution du flacon et/ou de la pipette pour mélanger.
PBS avec calcium et magnésiumN’importe quelle marque.
100x tampon Tris-EDTA (tampon TE)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10x tampon Tris-Borate-EDTA (tampon TBE)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE est une toxine pour la reproduction.
Solution d’acrylamide à 40 %Fisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021L’acrylamide est une toxine.
Persulfate d’ammonium (APS)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678Préparer une solution à 2 % dans un tampon TE. Le SAPL est une toxine et un irratant.
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281Préparer une solution à 20 % dans un tampon TE. TEMED est inflammable, corrosif et toxique.
Verre de protection rond de 12 mm de diamètreFisher Scientific (Pittsburg, Pennsylvanie
fishersci.com		12-545-82
Adhésif optique Norland 72Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
PlaqueN’importe quelle marque.
Microtubes à centrifugerN’importe quelle marque.
Sulfo-SANPAHProteoChem ou Thermo Fisher, (Rockland, IL)
proteochem.com ou thermofisher.com		C111 ou 22589Préparer une solution à 0,315 mg/ml dans l’eau immédiatement avant l’utilisation. Dissoudre à 37 ° ; C et filtrer stériliser. Il est normal d’observer du sulfo-SANPAH non dissous dans le filtre. Sulfo-SANPAH est sensible à la lumière et, par conséquent, la solution doit être protégée de la lumière jusqu’à l’exposition aux UV.
Poly-D-Lysine (PDL)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407Préparer une solution à 0,2 mg/ml dans l’eau et filtrer la stérilisation.
Collagène de type IAffymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813Préparez une solution à 0,2 mg/ml dans de l’acide acétique 0,2 N. La solution doit rester froide à tout moment pour éviter la polymérisation. L’acide acétique est un produit inflammable, toxique et corrosif.
22 x 60 verre de couvertureFisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
Pipette à déplacement positifGilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
Heatblock Fisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
SourcePlacez les gels aussi près que possible de la lumière UV. La lumière UV peut causer des lésions cutanées ou oculaires.
ThermomètreN’importe quelle marque.
Azote gazeuxGTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R
de culture tissulaire à 24 puits de lumière UV

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).
  2. Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A.

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DNA Crosslinked HydrogelsPolyacrylamide Gel PreparationDNA Gel CrosslinkingSingle Stranded DNA DeliveryGel Elasticity ModulationCell Culture SubstratesMechanobiology ResearchDynamic Stiffness ControlFibroblast Neuron BehaviorOptical Glue Immobilization

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