Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

Summary

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Abstract

Hohe Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), kann eine Änderung des zellulären Redox-Status zu oxidativem Stress Zustand führen. Diese Situation führt zu Oxidation von Molekülen (Lipid, DNA, Protein) und führt zum Zelltod. Oxidativer Stress beeinflusst auch das Fortschreiten von verschiedenen pathologischen Zuständen, wie Diabetes, Retinopathie, Neurodegeneration und Krebs. Somit ist es wichtig, dass Werkzeuge definieren oxidative Stressbedingungen nicht nur auf der Ebene einzelner Zellen, sondern auch im Zusammenhang mit ganzen Organismen zu untersuchen. Hier betrachten wir die Zebrafisch-Embryos als nützliches in vivo-System, solche Studien durchführen und präsentieren ein Protokoll zur in vivo oxidativen Stress messen. Unter Ausnutzung der Fluoreszenzsonden ROS und Zebrafisch transgenen fluoreszierende Linien entwickeln wir zwei verschiedene Methoden zur oxidativen Stress in vivo zu messen: i) eine "ganze Embryo ROS-Nachweisverfahren" für die qualitative Messung von oxidativem Stress und ii) ein "Einzelzell ROS Nachweisverfahren "für quantitative Messungen von oxidativem Stress. Hier zeigen wir die Wirksamkeit dieser Verfahren durch Erhöhung von oxidativem Stress in Geweben von Oxidationsmittel und physiologische oder genetische Methoden. Dieses Protokoll ist zugänglich für zukunfts genetischen Bildschirme, und es wird in Tiermodellen der oxidative Stress-Erkrankungen wie neurologische Störungen und Krebs helfen Adresse Ursache-Wirkungsbeziehungen von ROS.

Introduction

Oxidativer Stress ist speziell als eine Bedingung, die aus einem unsymmetrischen zellulären Redox-Zustand ergibt definiert. Die komplexen Redox-Reaktionen, die routinemäßig in den Zellen auftreten, bestimmen die zellulären Redox-Zustand. Redox-Reaktionen umfassen alle chemischen Reaktionen, die in der Übertragung von Elektronen zwischen den Atomen von biologischen Molekülen Herstellung Reduktion und Oxidation von Molekülen (dh Redoxreaktionen) bestehen. Diese Reaktionen werden durch elektronisch aktivierten Spezies (dh pro-oxidativen Spezies), die durch eine extreme strukturelle Instabilität und spontane Aktivierung von unsymmetrischen Elektronen, die mit den Nachbar Biomolekülen auszutauschen gekennzeichnet katalysiert. Diese Reaktionen führen in unregelmäßigen DNA-Schäden, Protein Carboxylierung und Lipidoxidation, und schließlich zum Zelltod führen ^1. Erhöhten oxidativen Stress mit dem Altern und dem Fortschreiten von verschiedenen pathologischen Zuständen ² verbunden. Oxidativer Stress hatberichtet für Gefäßveränderungen bei Diabetes und Herzkreislauferkrankungen ^3,4 verantwortlich zu sein. Es spielt auch eine kritische Rolle bei der neuronalen Degeneration bei Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit ^5. Außerdem hat oxidativen Stress als kritischer Faktor bei der Steuerung der Tumorprogression und metastatischen Ereignisse ^6,7 nachgewiesen. Darüber hinaus können Entzündungen und Immunreaktionen auslösen und weitere Unterstützung oxidativen Stress ^8.

Oder Stickstoff (RNS; reaktive Stickstoffspezies) in lebenden Zellen sind pro-oxidativen Spezies von Sauerstoff (reaktiver Sauerstoffspezies, ROS) abgeleitet. ROS sind das Hydroxyl-Radikal, das Superoxid-Anion ^(OH.) (O ₂ ^-) und Wasserstoffperoxid (H ₂ O _2). Der primäre RNS ist Stickoxid ^(NO).. Eine Reihe von sekundären reaktiven Spezies können durch spontane Wechselwirkung zwische erzeugt werdenn ROS und RNS oder freien Metallen Ionen ^9. Beispielsweise reagiert das Superoxid-Anion mit Lachgas zu Peroxynitrat (ONOO ^-) zu bilden, während H ₂ O _2-Reaktion mit Fe ^{2 +} Hydroxylradikale erzeugt. ROS und RNS, die aufgrund ihrer Fähigkeit, mit verschiedenen Biomolekülen reagieren, werden als gefährliche Bedrohung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Redox-Zustand ^10. Zur Aufrechterhaltung der Redox-Zustand-Zellen werden mit einer Reihe von entgiftende Anti-Oxidationsmittel-Molekülen und Enzymen ausgestattet. Die Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase, Glutathion-Peroxidase und Peroxiredoxine bilden im Wesentlichen die Anti-Oxidationsmittel enzymatisch-Arsenal, das Zellschutz bietet von pro-oxidative Arten, darunter H ₂ O _2, OH und OONO ^{-. 11.} Auch Anti-Oxidationsmittel-Moleküle wie Vitamin C und E, Polyphenole und CoenzymeQ10 (CoQ10) sind von entscheidender Bedeutung für ROS und ihre gefährlichen de löschenDerivate ^12,13. Verschiebt sich jedoch eine übermäßige Produktion von ROS und RNS oder einer Funktionsstörung in dem Antioxidationsmittel-System, das zelluläre Redox-Zustand zu oxidativem Stress ^14.

Neben ihren negativen Beigeschmack, können ROS verschiedenen physiologischen Rollen in Zellen verschiedener Herkunft zu spielen. Die Zellen produzieren normalerweise ROS als Signalmoleküle in den normalen biologischen Ereignisse wie der Wirtsabwehr und Wundheilung ^15-17 vermitteln. Reaktiven Spezies werden normalerweise in Zellen durch intrazelluläre Enzyme, wie NOX (NADPH Oxidase) und XO (Xanthin-Oxidase) in Reaktion auf Signalfaktoren, Wachstumsfaktoren und intrazelluläre Calciumspiegel Schwankungen ^18,19 hergestellt. Es wurde berichtet, dass ROS differentiell moduliert die Aktivität wichtig Kernfaktoren wie p53 oder zellulären Komponenten, wie das ATM-Kinase, ein Hauptregulator der Antwort auf DNA-Schädigung ^20. Analog ROS stark beeinflussen zelluläre Signal durch Vermittlung thE-Oxidation und Inaktivierung von Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs), die als kritische Regulatoren der Signaltransduktion ²¹ etabliert sind. Außerdem zeigen Proteom Methodik, dass RNS auch für spezifische Protein Modifikationen und Änderungen der molekularen Signal verantwortlich. RNS reagieren mit den Cystein-Thiolgruppen modifiziert sie in S-nitrothiols (SNO) und Trigger molekularen Signalwege gleichzeitig mit pathologischen Zuständen, wie entzündliche und Autoimmunerkrankungen ^22,23.

Da Zellkulturexperimenten die Vielzahl der in-vivo-wirkende Faktoren nur teilweise zu reproduzieren, von großem Interesse ist es Redox-Studien in Tiermodellen ^24,25 durchzuführen. Um dies zu erreichen, hat der Zebrafisch wurde als geeignete Wirbeltiermodell für oxidativen Stress Dynamik ²⁶ studieren. Der Zebrafisch ist ein neues Modell, das System mehrere Vorteile, zellulären und genetischen Ereignisse während Wirbel dev Stipendienelopment und Krankheit. Große Cluster von Embryonen erzeugt und verfügbar werden wöchentlich für experimentellen Anforderungen. Darüber hinaus ist die außergewöhnliche optische Klarheit der Zebrafisch-Embryonen sowie ihrer geringen Größe ermöglicht die Einzelzell-Imaging und dynamische Tracking in einem ganzen Organismen ^27. In den letzten zehn Jahren eine beträchtliche Anzahl von Zebrafisch-Mutanten wurden erzeugt, um menschlichen Krankheitszuständen wie Krebs und genetischen Krankheiten ^28-31 modellieren. Am wichtigsten ist, eine Vielzahl von transgenen Linien wurde erstellt, um umfangreiche Möglichkeiten der genetischen und biologischen Manipulationen ³² zu ermöglichen. Zum Beispiel sind transgene Zebrafisch gewebespezifische Leitungen regelmäßig auf in-vivo-Studien verwendet. Diese Linien exprimieren ein Fluoreszenzprotein unter der Kontrolle eines ausgewählten Promotors und bietet die Möglichkeit, Einzelzellen in vivo zu identifizieren, sowie die anatomische Struktur, die sie umfassen.

Mehrere toxikologischen Studien haben bereits verwendet ter Zebrafisch, um die in vivo Wirkung von Chemikalien auf Redox-Homöostase zu bewerten, was die Eignung dieser Wirbel als Tiermodell für den Bereich der Arzneimittelforschung und oxidativen Stress ^33-35. Auch wenn einige fluoreszierende Sonden wurden getestet, um oxidativen Stress in Zebrafisch-Larven ^36,37 zu überwachen, gibt es keine eindeutigen Tests zu erkennen und zu messen, die Niveaus von oxidativem Stress in Zebrafisch-Gewebe und lebenden Zellen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur in vivo Quantifizierung von oxidativem Stress in lebenden Zellen von Zebrafischembryonen. Imaging-Tools, FACS-Sortierung, fluoreszierende Sonden und pro-oxidative Bedingungen kombiniert, um eine einfache Test für den Nachweis und die Quantifizierung von oxidativen Spezies in Zebrafischembryos und Geweben zu erzeugen.

Protocol

1. Vorbereitung der Instrumente und Arbeitslösungen Bereiten Sie die Fisch-Wasser-Lösung. Machen Sie eine Stammlösung durch Lösen von 2 g Meersalz "Instant Ocean" in 50 ml destilliertem Wasser. 1,5 ml der Stockfisch Wasser auf 1 L destilliertem Wasser zur Vorbereitung bereit, Fisch Wasser (60 ug / ml Meersalze Endkonzentration) zu verwenden. Autoklavieren bereit, Fisch Wasser vor Gebrauch zu verwenden. Diese Lösung wird als Zebrafischembryo Medium verwendet. Bereiten Methylcellulose f…

Representative Results

Durch die Anwendung der hier beschriebenen Verfahren können wir leicht erkennen, messen und oxidativen Stress (und ROS) im Zebrafisch embryonalen Geweben. Nach der Überquerung erwachsenen Zebrafisch, werden die Eier gesammelt und bei 28 ° C bis 72 Stunden nach der Befruchtung (hpf) zu entwickeln. Um oxidativen Stress zu induzieren, schlagen wir zwei verschiedene Ansätze: 1) die Behandlung der Embryonen mit starken pro-oxidative Reagenzien oder 2) Förderung der ROS-Bildung nach Gewebeverletzung. <p class="jove_c…

Discussion

Kritische Schritte

Das Verfahren für die Erkennung von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen hier beschriebenen zwei verschiedenen Methoden. Der ganze Berg ROS-Nachweismethode ist vor allem ein qualitativer Test zur ROS-Erkennung, während die einzelne Zelle ROS-Detektionsverfahren ermöglicht eine spezifische quantitative Messungen (Abbildung 1). Beide Methoden bieten eine schnelle und einfache Möglichkeit, in vivo ROS-Erkennung auf Zebrafischembryonen zu beurte…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Hydrogen peroxide solution	SIGMA	516813	DO NOT STORE DILUITIONS
Hank's Balanced Salt Solution 1X	GIBCO	14025
Methyl cellulose	SIGMA	M0387
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture	INSTANT OCEAN	SS15-10
Tricaine	SIGMA	A5040
Cgeneric ROS-sensitive probe:                              CellROX Deep Red Reagent	INVITROGEN	C10422
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX	INVITROGEN	M36008	dissolve one vial with 13μl of DMSO
Hydroethidine	INVITROGEN	D23107
Rotenone	SIGMA	R8875	Prepare 5mM stock solution in DMSO.
Dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2650
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine	EnzoLifeScience	BML-EI395	dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water
Propidium Iodide	Molecular probes       (Life Technologies)	P3566
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	Molecular probes         (Life Technologies)	A1310
Nrf2a Morpholino	GeneTools	5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3'	Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 )
Collagenase P	ROCHE	11213857001	Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO	10010-056
Fetal Bovine Serum	GIBCO	10082-147
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	ROCHE		Dissolve one tablet in 1ml of water
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red	GIBCO	15400-054	Prepare 1X working solution before usage
Compound microscope	ZEISS
Stereo microscope with fluorescent illumination	Nikon	AZ100
camera	ZEISS	AxioCamMRm
software for fluorescence image acquisition	ZEISS	ZEN 2011
Fluorescence-activated cell sorter	BD FACSCalibur
Centrifuge	Eppendorf	5417R
FACS tubes	BD	342065
Multiwell Plate	BD Falcon	353047
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm	VWR	391-1915
Confocal microscope	Leica	Leica SP5