عزل الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البشرية سرطان البروستاتا
Summary
عزل الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) مباشرة من الأنسجة البشرية اللازمة لتوصيف البيولوجية. يصف هذا المخطوط منهجية لعزل الخلايا الجذعية السرطانية في البروستاتا من الأنسجة البشرية، مع توفير النصائح حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها الخطوات الصعبة.
Abstract
وقد نموذج سرطان الخلايا الجذعية (CSC) النظر إلى حد كبير على مدى العقدين الماضيين. خلال هذا الوقت تم تحديد الخلايا الجذعية السرطانية ومعزولة مباشرة من الأنسجة البشرية ونشر متسلسل في الفئران العوز المناعي، وعادة من خلال وضع العلامات الضد من مجموعات سكانية فرعية من الخلايا وتجزئة من قبل التدفق الخلوي. ومع ذلك، فإن المظاهر السريرية فريدة من سرطان البروستاتا قد حدت كثيرا من دراسة الخلايا الجذعية السرطانية في البروستاتا من عينات الورم الإنسان الطازجة. نحن ذكرت مؤخرا عزل الخلايا الجذعية السرطانية في البروستاتا مباشرة من الأنسجة البشرية بحكم فئة HLA على النمط الظاهري الأول (HLAI) سلبية. ويتم حصاد خلايا سرطان البروستاتا من العينات الجراحية وفصلها ميكانيكيا. يتم إنشاء تعليق خلية وصفت مع HLAI وانسجة الأجسام المضادة مترافق fluorescently. يتم عزل مجموعات سكانية فرعية من الخلايا HLAI سلبية أخيرا باستخدام تدفق عداد الكريات. القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هي طبيعة كثير من الأحيان المجهرية ومتعدد البؤر للالسرطان الأولية في عينات البروستاتا. مع ذلك، الخلايا الجذعية السرطانية معزولة البروستاتا الحية هي مناسبة للالتوصيف الجزيئي والتحقق من صحة وظيفية عن طريق زرع في الفئران العوز المناعي.
Introduction
ويعتبر عدم التجانس Intratumoral أن تكون السمة المميزة للسرطان 1. في الواقع، وقد وصفت عدة آليات من عدم التجانس intratumoral، بما في ذلك الطفرة الجينية والتفاعل مع المكروية. بالإضافة إلى ذلك، قد تحتوي بعض أنواع السرطان التسلسل الهرمي الخلوية مع جزء من السكان من الخلايا الجذعية السرطانية (الخلايا الجذعية السرطانية) التي يسلك خصائص القدرات بدء الورم والتجديد الذاتي في المسلسل المقايسات زرع 2-5. وصفت في البداية في الدم 6، 7 الثدي، والدماغ 8 الأورام الخبيثة، كما تم دراسة الخلايا الجذعية السرطانية في سرطان البروستاتا 9-12 وكذلك أنواع الأورام الأخرى 2-5.
وتعتبر الخلايا الجذعية السرطانية عموما جزء الخلوية ضمن مجموعة من السكان غير متجانسة 2-5. وبالتالي، فإن توصيف وظيفي والجزيئية الخلايا الجذعية السرطانية يتوقف على تخصيب بهم من السكان بكميات كبيرة. وفقا لذلك، وخلال العقدين الماضيين عدة التقىوقد وضعت hodologies تخصيب CSC التي تنطوي عادة على الفصل بين السكان وصفت من قبل التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، النظر كبيرة في دراسة الخلايا الجذعية السرطانية هي أن التنظيم الهرمي للأنسجة البشرية قد تعطلت بسبب التلاعب التجريبية مثل الركض المسلسل في الثقافة أو العوز المناعي الفئران. ونتيجة لذلك، برزت العزلة المباشر من الخلايا الجذعية السرطانية من الأنسجة البشرية باعتبارها منهجية مهمة في مجال CSC.
سرطان البروستاتا هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات بالسرطان في الولايات المتحدة وحول العالم 13. وبالتالي، فإن العزلة وتوصيف الخلايا الجذعية السرطانية في البروستاتا البيولوجية هو من مصلحة كبيرة. سبق المخصب الخلايا الجذعية السرطانية في البروستاتا من خطوط الخلايا، والمريض المستمدة xenografts، ومرور منخفض المريض المستمدة الثقافات التعليق 9،10،12،14.
نحن ذكرت مؤخرا عزل الخلايا الجذعية السرطانية في البروستاتا مباشرة من ق الجراحية الإنسانamples بحكم بهم، HLAI السلبية سطح الخلية النمط الظاهري 10. نحن هنا بالتفصيل الإجراءات التي تم تنفيذها لعزل هذه الخلايا. ويتم حصاد أورام البروستاتا من العينات الجراحية وتقدم الى الايقاف الخلية. ثم هي ملطخة الخلايا باستخدام أجسام مضادة ضد HLAI فضلا عن اللحمية والجدوى علامات، ويتم عزل الخلايا الجذعية السرطانية عن طريق تنشيط الخلايا مضان الفرز (FACS). ويمكن بعد ذلك الخلايا الجذعية السرطانية المعزولة أن تستخدم لفحوصات تتطلب خلايا قابلة للحياة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول عزلة الخلايا الجذعية السرطانية من أنسجة سرطان البروستاتا البشرية الطازجة. عدة اعتبارات هامة تؤثر على نتيجة ناجحة من هذا البروتوكول.
استعادة أعداد كبيرة من خلايا سرطان البروستاتا قابلة للحياة تعتمد على تقييم ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة الحريري ومؤسسة الأسرة TJ مارتل.
Materials
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
| 60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645-648 (1994).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).
- Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).
- Qin, J., et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Patrawala, L., et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
