Harmonic Nanopartículas Regenerativa Research
Summary
Detalhes do protocolo estão previstas in vitro de células-tronco embrionárias humanas em matéria de rotulagem com a segunda geração de nanopartículas harmônicas. Também são apresentadas as metodologias de investigação hESC por microscopia multi-fotão e sua diferenciação em aglomerados cardíacas.
Abstract
Neste experimento visualizados, detalhes do protocolo são fornecidos para marcação in vitro de células-tronco embrionárias humanas (hESC) com nanopartículas de geração harmônica segundo (HNPs). Estes últimos são uma nova família de sondas introduzidas recentemente para a rotulagem de amostras biológicas para imagens multi-fotão. HNPs são capazes de dobrar a freqüência de luz de excitação pelo processo de óptica não-linear de geração de segundo harmônico, sem restrição do comprimento de onda de excitação.
Multi-fóton metodologias para hESC diferenciação em clusters cardíacos (mantidos como culturas de ar líquido longo prazo) com base são apresentados em detalhe. Em particular, as evidências sobre como maximizar a intensa segundo harmônico (SH) emissão de HNPs isoladas durante o monitoramento 3D de bater o tecido cardíaco em 3D é exibido. A análise das imagens resultantes para obter padrões de deslocamento 3D também é detalhado.
Introduction
Sistemas de microscopia não-lineares, graças às suas inerentes três capacidades de seccionamento dimensionais, têm cada vez desencadeada a demanda por fluoróforos foto-estável, com bandas de absorção de dois fótons do infravermelho próximo. Só no último par de anos, para complementar o desenvolvimento de rótulos baseados em fluorescência (corantes, pontos quânticos, a converter nanopartículas), uma metodologia diferente de imagem vem explorando o uso de uma nova família de nanopartículas inerentemente não-lineares como rótulos, ou seja, nanopartículas de harmônicas (HNPs) que foram desenvolvidos especificamente para microscopia multi-fotão. Esses rótulos, baseadas em cristais inorgânicos, noncentrosymmetric exercer contraste óptico gerando o SH da freqüência de excitação: por exemplo, através da conversão de uma fração de perto a luz de excitação pulsada infravermelho (λ = 800 nm) para a luz azul visível (λ / 2 = 400 nm) . Vários autores no passado recente têm testado diferentes materiais, incluindo iodato de ferro Fe (IO <sub> 3) 3 1, niobato de potássio (KNbO 3) 2, de niobato de lítio (LiNbO 3) 3, o titanato de bário (BaTiO3) 4,5, fosfato de potássio de titanilo (KTiOPO4, KTP) 6-8, e o óxido de zinco (ZnO ) 5,9,10. Em comparação com sondas fluorescentes, HNPs possuem uma série de propriedades interessantes, como ausência completa de branqueamento e piscando, bandas de emissão estreitas, tunability excitação-comprimento de onda (do ultravioleta ao infravermelho), a capacidade de recuperação de orientação e resposta óptica coerente. Estas propriedades únicas foram recentemente explicou em dois artigos de revisão abrangente 11,12. A possibilidade de trabalhar na região espectral do infravermelho, o que aumenta a profundidade da imagem, minimizando a dispersão e absorção, também limita drasticamente a degradação foto da amostra 13,14. Além disso, o sinal de foto-estável infinitamente garantida pelo HNPs torna sondas ideais para rastreamento de células de longo prazo, que ié particularmente atraente para aplicações de medicina regenerativa 15.
Neste experimento visualizados, detalhes do protocolo são fornecidos para marcação in vitro de células-tronco embrionárias humanas (hESC) com HNPs não funcionalizados. A síntese e preparação de suspensões coloidais é detalhado em publicação anterior e em referências citadas 16 e está fora do escopo deste trabalho. Metodologias de investigação hESC por microscopia multi-fotão e sua diferenciação em clusters cardíacos (mantidos como culturas de ar líquido longo prazo) são apresentados. CES humana pode ser deixado para diferenciar dentro chamados corpos embrióides (EBS) de duas maneiras diferentes, ou por formação de EB fragmentos de colónias em suspensão ou, em alternativa, a agregação de células individuais em EB utilizando a placa Aggrewell forçados, como ilustrado na Figura 1A . Cultivar batendo aglomerados de células cardíacas com politetrafluoretileno (PTFE) filtros porosos facilitates sua manutenção a longo prazo para estudos posteriores (por exemplo medidas eletrofisiológicas de potenciais de ação).
A fonte de excitação do microscópio de varrimento deve ser capaz de fornecer impulsos de ultrashort (com uma duração de impulso mais pequena do que 300 FSEC na amostra), a fim de atingir a potência de pico necessária para realizar segunda imagem harmónica de HNPs. Por exemplo, o FSEC-fonte mais comum usado para geração de imagens são ajustáveis Ti: Safira lasers. Alternativamente, outros lasers ultra-rápidos podem ser empregados, por exemplo, de íons de érbio 17, cromo forsterite 18 ou Ti: Safira bombeado infravermelhos osciladores paramétricos ópticos. O microscópio pode ser equipado com uma objectiva com uma preferência relativamente elevada abertura numérica. Muito importante, antes de medições, e cada vez que o objetivo é substituído, é obrigatório para minimizar a dispersão presente no set-up (lentes), otimizando as configurações do pulso de laser pré-compressor no trabalhocomprimento de onda de escolha. Este procedimento, detalhado no protocolo, garante que o impulso de laser, é o mais próximo possível para o transformar duração limitada (ou seja, mais curto quanto possível) no plano focal e maximiza a resposta da amostra não-linear.
O objectivo da análise de imagem descrito no final do protocolo é a identificar e controlar os movimentos em 3D HNPs associados com as contracções rítmicas do bater aglomerados cardíacas. Nanopartículas de rastreamento no plano de imagem é simplesmente realizado através da identificação de suas posições em quadros do filme sucessivos. Para extrair a informação sobre o movimento axial, uma calibração prévia da resposta não linear da intensidade como uma função do deslocamento axial é obrigatório. Note-se que para a medição a longo prazo, um controlo activo interferométrico da posição axial da amostra é requerida para manter a validade da curva de calibração, na presença de desvios térmicos e / ou mecânicos.
Os HNPs utilizados aqui para traccélulas e batendo nos agregados são baseados em óxido de potássio niobato (KNbO 3), mas outros nanomateriais não lineares disponíveis são analisados em detalhe no trabalho de Staedler et al 16.
As eficiências ópticos não-lineares da maioria dos nanomateriais investigados até agora são muito comparáveis. A escolha para KNbO 3 foi motivado essencialmente pela boa estabilidade da solução coloidal e sua boa biocompatibilidade, testado em várias linhas de células humanas, mesmo em concentração razoavelmente elevada e longos tempos de exposição 16.
Dada a novidade do nanomaterial empregada para este trabalho, as principais características do HNPs em comparação com / luminescentes bio-marcadores fluorescentes são mostrados em uma animação de vídeo original do computador curta realizado pelos autores.
Protocol
Representative Results
Discussion
A aplicação da nanotecnologia à investigação em células estaminais é um relativamente novo, mas em rápida expansão campo. Como foi assinalado por vários artigos de revisão sobre o assunto, o uso de nanopartículas pode ser aplicada para realizar tarefas diferentes de pesquisa, variando a partir de células de monitoramento (tanto in vitro como in vivo), para a distribuição intracelular de proteínas e genes, não menos importante, a criação de ambientes celulares biomiméticos para prefe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o financiamento parcial do Projeto de Pesquisa FP7 NAMDIATREAM Europeia (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) eo projecto INTERREG IV França-Suíça NAOMI.
Materials
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37°C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | CFI Plan Fluor 10x | NA 0.30, WD 16 mm |
| CFI Plan Apo 20x | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40x | NA 1.25, WD 0.18mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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