La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Summary

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

Abstract

Electroforesis en gel bidimensional (2DE) es una poderosa herramienta para descubrir modificaciones proteoma potencialmente relacionados con diferentes condiciones fisiológicas o patológicas. Básicamente, esta técnica se basa en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico en un primer paso, y en segundo lugar, de acuerdo con sus pesos moleculares por SDS electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). En este informe se describe un protocolo de preparación de muestras optimizado para poca cantidad de tejido post-mortem y el cerebro del ratón humano. Este método permite realizar tanto la electroforesis bidimensional diferencia de fluorescencia de gel (2D-DIGE) y mini inmunotransferencia 2DE. La combinación de estos enfoques le permite a uno no sólo encontrar nuevas proteínas y / o modificaciones de las proteínas en su expresión gracias a su compatibilidad con detección por espectrometría de masas, sino también una nueva visión de la validación de marcadores. Así, mini-2DE acoplado a los permisos de transferencia Western para identificar y validar mensaje-Translacional modificaciones, proteínas catabolismo y proporciona una comparación cualitativa entre diferentes condiciones y / o tratamientos. En este documento, se proporciona un método para estudiar los componentes de los agregados de proteínas que se encuentran en la EA y la demencia con cuerpos de Lewy, tales como el péptido beta-amiloide y de la alfa-sinucleína. Nuestro método de este modo puede ser adaptado para el análisis del proteoma y las proteínas insolubles extraer a partir de modelos de tejido cerebral y ratones humanos también. En paralelo, puede proporcionar información útil para el estudio de las vías moleculares y celulares implicados en enfermedades neurodegenerativas, así como potenciales biomarcadores y dianas terapéuticas.

Introduction

Los trastornos mentales y neurológicos representan el 13% de la carga mundial de la enfermedad, los nuevos desafíos como los mecanismos fisiopatológicos, factores de riesgo y biomarcadores prodrómicos deben explorarse ^1. En línea con este objetivo, la proteómica estudios del cerebro humano se convierten en indispensables para destapar las vías moleculares implicadas en procesos como la memoria, el comportamiento, las emociones y la plasticidad neuronal, por ejemplo, no sólo para fisiológica, sino también para las condiciones patológicas. Por lo tanto, el uso de modelos animales y, más específicamente los ratones transgénicos, aporta una amplia gama de posibilidades para imitar la etiología de los trastornos neurodegenerativos humanos ^2.

Proteómica enfoques son hoy en día disponibles con el fin de llevar a cabo estas nuevas perspectivas en el campo de la neurociencia. Electroforesis en gel bidimensional (2DE) es un método simple y potente probable que permite comparar el proteoma de una amplia gama de muestras. Por otra parte, también es unpoderoso método para aislar una proteína de una mezcla compleja con el fin de identificar y analizar adicionalmente por espectrometría de masas. Esta técnica consiste esencialmente en dos etapas sucesivas: 1) de separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico (pI) por isoelectroenfoque (IEF). Más precisamente, un potencial eléctrico se aplica a través de las tiras de acrilamida inmobilina entre un gradiente de pH y luego proteínas migrará y se centran en un determinado pI en función de su carga neta global. 2) proteínas isoeléctricamente se centraron se desnaturalizan y cargados negativamente por la adición de dodecil sulfato de sodio (SDS), con lo que las proteínas en su primera estructura se separan en función de su peso molecular aparente (MW) por SDS-PAGE ^3. Estas dos propiedades distintas nos permiten abordar un doble valor para ir más lejos en el estudio del proteoma. Por una parte este enfoque ofrece la posibilidad de realizar un análisis cuantitativo usando colorantes mínimos método 2D-DIGE, y por otro lado un CUALITATIVOanálisis e por mini-2DE acoplado a Western Blot.

El análisis cuantitativo por 2D-DIGE confiere expresión de la proteína cambia en todo el proteoma de la muestra. Brevemente, las muestras se etiquetan con tres cianinas (Cy2, Cy3 y Cy5) que emiten a tres longitudes de onda distintas (azul, verde y rojo). Estos colorantes mínimas de flúor que contienen grupo éster de succinimidil-N-hidroxi reaccionan con el grupo ε-amino de lisinas residuos de proteínas resultantes en enlaces amida covalentes ^4. Residuos de lisina están etiquetados sólo entre el 1-3% y evitando así múltiples etiquetas además por la proteína y de las principales modificaciones de carga neta de ^{5, 6.} Cy3 y Cy5 se utilizan a menudo para etiquetar dos muestras independientes mientras Cy2 Etiquetas Una mezcla de partes iguales de las muestras para comparar. Las dos ventajas principales son que todas las muestras marcadas se mezclan y IEF y SDS-PAGE se llevan a cabo en un gel de una sola vez para cada paso, evitando la variabilidad entre los experimentos debido a geles comparación. Por otra parte, presenta un umbral de detección máximo de alrededor de 1 femtomol de proteína ^7. Los geles se escanearon y el software 2D compara las imágenes de fluorescencia de gel 2D, donde Cy2 sirve como un estándar interno que permite la identificación de las diferencias estadísticas entre los puntos para su posterior identificación por espectrometría de masas. El software de análisis de 2D utilizando el patrón interno logra una detección rápida de menos de 10% de las diferencias entre las muestras con más de 95% de confianza estadística ^8.

Análisis cualitativo de mini-2DE es un paso crucial para la caracterización de proteínas. El principio es el mismo que el descrito anteriormente para el PI y la separación MW, pero en este caso las proteínas se transfieren a partir de un gel de poliacrilamida a una membrana pequeña y la inmunotransferencia se realiza después. Mientras que una electroforesis en gel de dimensión proporciona los cambios en la expresión de la proteína para uno o varios epítopos de la proteína en función del anticuerpo, la Informaciónn de mini-2DE dota con dos parámetros adicionales. En primer lugar, los isovariants proteínas cambian en función del pI, lo que indica que las modificaciones posteriores a la traducción pueden tener lugar. En segundo lugar, la identificación de la espectrometría de masas puede ser indicativo de zimógenos plausibles y productos catabólicos de proteínas. Por lo tanto, las modificaciones observadas por 2D-DIGE es probable indicativa de los mecanismos de cambios en el perfil global de proteoma subyacentes. Alineaciones de inmunoblots entre varias muestras para el mismo epítopo de proteína / s por el mini-2DE pueden reflejar los cambios de acidez Arrojando luz sobre las variaciones posteriores a la traducción un poco observados o ni siquiera por inmunotransferencia monodimensional ^{9, 10.} Por otra parte, este análisis informa acerca de los sitios de escisión potenciales debido al conocimiento de la pI y MW de los residuos metabólicos ^11,12.

La combinación de estas dos técnicas proporciona un análisis de proteómica complementaria. Por un lado 2D-DIGE permite un tipE de diferencias que permiten un aislamiento precisa de polipéptidos cuya expresión es diferente. Estas diferencias consisten esencialmente en la aparición o desaparición de un lugar o de aumento / disminución de la intensidad de un uno determinado por el análisis de software de los geles fluorescentes. Sin embargo, estas observaciones por sí mismos son poco probable para explicar la naturaleza de la modificación observada. Por estas razones, una vez que el polipéptido se aísla y se identificó por espectrometría de masas, el uso de mini-2DE permite confirmar precisamente 1) la identidad de la proteína aislada y 2) la naturaleza de la diferencia: el cambio en el nivel de isovariant / isoforma de de expresión, las modificaciones post-traduccionales y procesos de escisión por ejemplo. Sin embargo, es necesario desarrollar un tampón de lisis a partir tanto compatible con 2D-DIGE y con mini-2DE con el fin de limitar las dispersiones potenciales resultantes de la utilización de protocolos de extracción que son muy diferentes.

En el presente artículo, nos dèse describe un protocolo adaptado para la preparación, la extracción y el rendimiento de técnicas de mini-2DE de las proteínas cerebrales procedentes de tejido humano y de ratón 2D-DIGE y.

Protocol

1. La homogeneización y extracción total de proteínas de tejido cerebral humano y ratón Homogeneización del tejido cerebral. Homogeneizar el tejido cerebral 10% (w / v) en 8 M de urea, 2 M tiourea y 1% w / v de tampón de SDS (UTS) utilizando un Potter de vidrio (para muestras de humanos) o Teflón homogeneizador (para muestras de ratones). Someter a ultrasonidos a 60 Hz 30 pulsos con un generador de aplicación de ultrasonidos 0,5 seg para la desintegración total de tejido 13, 14. D…

Representative Results

Proteómica en el tejido cerebral sigue siendo un reto ya que no existe tampón ideal para recuperar el 100% de las proteínas, especialmente asociada a la membrana o proteínas del citoesqueleto. La primera serie de experimentos se centraron en la búsqueda de un tampón de lisis adecuado compatible con los dos enfoques y que permite recuperar un gran panel de proteínas. Por lo tanto, tres tampones de lisis se ensayaron para determinar la más adecuada. En primer lugar, se utilizó el tampón bioquímicas y de biolog?…

Discussion

El descubrimiento de los cambios de expresión de proteínas patológicas, la búsqueda de biomarcadores y la modulación de las posibles vías de dianas farmacológicas se encuentran entre los objetivos de los enfoques neuroproteomics ^30. En medio de las herramientas emergentes, el campo 2DE agrega una expectativa prometedora. Sin embargo, un consenso se debería alcanzar con el fin de minimizar la variabilidad y aumentar la reproducibilidad en los experimentos. En la línea de esta idea de un protocolo esta…

Materials

CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval/size
IPG Buffer, pH X-X	GE Healtcare		Reference in function of the pH interval desired
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	Plastic box to make the passive rehydration
MILLEX GS Filter	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)	Bio-Rad		Reference in function of the MW to separate
IPGphor III Isoelectric Focusing Unit	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix Large Electrophoresis System	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm	Gel Company	P2D1.5