Lignine Neerregeling van<em> Zea mays</em> Via dsRNAi en Klason Lignine Analyse

Summary

Een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek wordt toegepast om down-reguleren van de maïs cinnamoyl co-enzym A-reductase (ZmCCR1) gen tot lagere planten ligninegehalte. Lignine down-regulatie van de celwand wordt gevisualiseerd door microscopische analyses en gekwantificeerd door de Klason methode. Compositionele veranderingen in hemicellulose en cellulose geanalyseerd.

Abstract

Om het gebruik van lignocellulosische biomassa als alternatief bio bron tijdens biologische omzettingsprocessen vergemakkelijken, is een voorbehandeling noodzakelijk het openstellen van de structuur van de celwand van planten, waardoor de toegankelijkheid van de celwand koolhydraten. Lignine, een polyfenolische materiaal in vele soorten celwand, staat bekend als een belangrijke belemmering voor toegang enzym. Vermindering van lignine-gehalte tot een niveau dat niet interfereert met de structurele integriteit en het afweersysteem van de plant kan een waardevolle stap om de kosten van de bio-ethanol productie te verminderen. In deze studie hebben we genetisch neerwaarts gereguleerd een van de lignine biosynthese-genen, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via een dubbelstrengs RNA interferentie techniek. De ZmCCR1_RNAi construct is geïntegreerd in het genoom van maïs met de deeltjesbeschieting methode. Transgene maïsplanten groeiden normaal ten opzichte van het wildtype controleplanten zonder interfering met biomassa groei of afweermechanismen, met uitzondering van het tonen van bruin-kleuring in transgene planten blad mid-ribs, schillen en stengels. De microscopische analyse, samen met de histologische analyse onthulde dat het blad sclerenchym vezels werden verdund maar de structuur en de grootte van andere vasculaire systeemcomponenten niet veranderd. Het lignine-gehalte in de transgene maïs verminderd met 7-8,7%, werd de kristallijne cellulose gehalte stijgen na reductie lignine en hemicellulose onveranderd. De analyses kunnen aangeven dat koolstof stroom zou kunnen zijn verschoven van ligninebiosynthese biosynthese van cellulose. Dit artikel schetst de procedures voor neerwaarts reguleren van de lignine in maïs via RNAi technologie en de celwand samenstelling analyses gebruikt om het effect van de wijzigingen aan de celwandstructuur verifiëren.

Introduction

De productie van biobrandstoffen uit lignocellulose biomassa is zeer wenselijk vanwege de overvloed aanwezig in de VS ¹ en bij de duurzame oogst van landbouw en bosbouw residuen, het vermogen niet direct concurreren akkerland gebruikt voor voedsel en dierlijke distributienet. In tegenstelling tot maïs, die de belangrijkste bron van biobrandstoffen thans gerealiseerd in de VS, lignocellulose materialen aanzienlijk complexer en moeilijker af te breken. Naast de lange-keten koolhydraten, cellulose en hemicellulose, die de belangrijkste bronnen van suikers tijdens fermentatie van lignocellulose materialen, allerlei soorten planten celwanden ook lignine bevatten, een fenylpropanoïde polymeer die kracht, verdediging tegen pathogene aanval verschaft en hydrofobiciteit aan muren cel. Weliswaar noodzakelijk is voor de groei van planten en overleving, lignine presenteert ook een belangrijke belemmering voor de succesvolle enzymatische omzetting van de cellulose en hemicelluverliezen aan oplosbare suikers. Materialen met een hoog gehalte lignine zijn over het algemeen minder wenselijk materialen voor zowel de biobrandstof (via biologische omzetting pathways) en de pulp-en papierindustrie als gevolg van de negatieve gevolgen voor de verwerking van eigenschappen en kwaliteit van het product. Daarom zou genetische manipulatie van plantaardige materialen voor lignine reductie op een niveau dat niet interfereert met het gewas structurele sterkte en defensie systemen zijn belangrijk voor de verlaging van de productiekosten voor zowel de lignocellulose biobrandstof en de pulp-en papierindustrie.

In maïs (Zea mays), lignine covalent verknoopt hemicellulose in de primaire celwand via ferulate en diferulate bruggen ^2. Het lignine-hemicellulose complex bindt cellulose microfibrillen via waterstofbruggen vormen een complexe matrix die integriteit en sterkte verleent aan de secundaire celwand. De mechanische sterkte van plantenbiomassa wordt grotendeels bepaald door het type lignin subeenheden ^3-5. In eerdere studies, het veranderen van de verhoudingen van lignine subeenheden heeft aangetoond dat er geen duidelijke trend op enzymatische verteerbaarheid ^6-11. Echter, vermindering van de lignine-gehalte tonen over het algemeen een verbetering van conversies ^12,13 en kan een sleutel tot het verhogen van de verteerbaarheid van plantmateriaal door hydrolytische enzymen waaronder endocellulases, cellobiohydrolasen, en β-glucosidase ¹⁴ zijn.

Genetische manipulatie om de expressie van afschriften te reguleren is uitgebreid geoefend om gewaseigenschappen verbeteren. Geavanceerde technieken, waaronder anti-sense ¹⁵ en cosuppressie ¹⁶ technologieën, in staat effectief down-regulatie van target genen. Volledige gen knock-out is ook vooruitgang geboekt met behulp van gen-constructen die coderen voor-intron splicing RNA met een haarspeldstructuur ^17. Bovendien is een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek, dat wil zeggen een krachtige en effectieve genexpressie mediator die werkt door een gericht transcript afbraak of translatierepressie, verschaft een krachtig middel om uiteenlopende-onderdrukking op het doel mRNA ¹⁸ induceren. Gene silencing technieken tonen een aantal beperkingen. Deze technieken niet precies regelen het niveau van transcriptie en het kan onverwachte silencing effect van andere homologe genen veroorzaken.

In deze methode gebruikten we met deeltjes dragen de dsRNAi constructen in het maïsgenoom. Tot op heden, een breed scala aan plantensoorten zijn met succes getransformeerd met behulp deeltjesbombardement, Agrobacterium, elektroporatie, micro-injectie en methoden. In maïs genetische transformatie, de met deeltjes werkwijze is voordelig boven alle andere methoden, omdat het het meest efficiënt. Met deeltjes is niet afhankelijk van bacteriën en dus de werkwijze vrij van biologische beperkingen zoals de grootte van het gen, soort gen ofigin, of de plant genotype. De fysieke transgen levering systeem maakt een hoog moleculair gewicht DNA en meerdere genen in plantengenomen en in bepaalde gevallen moeten worden ingebracht in chloroplasten bij hoge transformatie-efficiëntie ^19. De lignine vermindering van het vasculaire systeem van het blad midden rib kan worden gevisualiseerd via scanning elektronen microscopie (SEM) die gunstig is voor de behandeling van de topografie en de samenstelling van de monsters.

In maïsplanten, twee cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1: X98083 en ZmCCR2: Y15069) genen werden gevonden in het maïsgenoom ^20. Cinnamoyl-CoA reductase katalyseert de omzetting van de hydroxycinnamoyl-CoA-esters in cinnamyl aldehyden. Wij kozen de ZmCCR1 gen neerwaarts reguleren dit enzym omdat het gen tot expressie wordt gebracht in alle weefsels lignifying. Het 523 nucleotiden aan het 3 'uiteinde van de ZmCCR1 gen werden gekozen voor een dsRNAi construct omdat de sequenties bleekmeer divers in vergelijking met die van ZmCCR2. Zo zou de dsRNAi construct juist alleen ZmCCR1 binden, het vermijden van off-target tot zwijgen ^21. Een ZmCCR1_RNAi construct werd ontworpen in de cytoplasmatische expressie systeem ImpactVector1.1-tag (IV 1.1) met de groene weefsel specifieke promotor, ribulose-1, 5-bisfosfaatcarboxylase oxygenase (RuBisCO).

Om de effecten van de dsRNAi construeren van transgene planten te bestuderen, werd de ligninegehalte gekwantificeerd. De Klason (zuur onoplosbaar) lignine meting bekend nauwkeuriger in vergelijking met het zuur reinigingsmiddel lignine kwantificering die enkele van de lignine oplosbaar ^22. Daarom werd de Klason lignine gemeten in transgene maïs stengels. Deze procedure bestaat uit twee stappen zure hydrolyse dat polymere koolhydraten omgezet in oplosbare monosacchariden ^23. De gehydrolyseerde biomassa werd vervolgens gefractioneerd in zuur oplosbare en onoplosbare materialenALS en het zuur onoplosbare lignine werd gemeten volgens eerdere studies ^23,24. Idealiter lignine analyse omvatten extracties met water en ethanol voordat de hydrolysestap, om oplosbare materialen die kunnen interfereren met de resultaten verwijderen en een post-hydrolyse verbranding van de lignine residu om eventuele as aanwezig in het residu. Zonder deze maatregelen zou de lignine van het monster kunstmatig worden opgeblazen. De volledige werkwijze wordt hier voorgesteld, maar voor onze experimenten konden wij beide stappen uitvoeren vanwege de kleine hoeveelheid materiaal voor het testen

Twee andere celwandcomponenten, cellulose en hemicellulose werden ook geanalyseerd in de lignine down-gereguleerde transgene maïs lijnen. Er is beschreven dat transgene planten die zijn down-gereguleerd in zowel de fenylalanine ammonia-lyase (PAL) ^25, 4-cumaraat: CoA ligase (4CL) ²⁶ of een cinnamyllcohol dehydrogenase (CAD) ²⁷ laten een toename in andere celwand structurele componenten. Als eerste stap in onze studies, werd kristallijne cellulose gemeten met de Updegraff methode ^28. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor bepaling van cellulose in een groot aantal cellulolytische bacteriën en schimmels. In het kort werden de gemalen maïs voorraden behandeld met Updegraff reagens (azijnzuur: salpeterzuur: water) aan hemicellulose, lignine en xylosans verwijderen. De kristallijne cellulose werd volledig gehydrolyseerd tot glucose via Saeman hydrolyse door toevoeging van H ₂ SO _4. De kristallijne cellulose werd vervolgens getest volgens de colorimetrische anthronwerkwijze ^29. Om te controleren of de inhoud hemicellulose zijn gewijzigd, werden de monosaccharide extracten van gemalen stengels gehydrolyseerd met trifluorazijnzuur, gederivatiseerd met de alditol acetaat werkwijze en vervolgens door gaschromatografie (GC) ³⁰ geanalyseerd. De gedetailleerde procedures voor kristallijne cellulose inhoud en matrix polysacchariden samenstelling analyses worden beschreven in Foster et al.. (2010) ^31.

Hier beschrijven we de procedures die worden gebruikt voor lignine down-regulatie in maïs via een RNAi-technologie, deeltjesbeschieting transformatie, en lignine-analyse voor een versnelde afbraak van maïs lignocellulose in fermenteerbare suikers voor biobrandstoffen.

Protocol

1. Voorbereiding van dsRNAi constructen gebruikt voor de Neerregeling van ZmCCR1 Ontwerp gen specifieke primers inclusief de nodige restrictie-enzym plaatsen voor het maken van een dsRNAi construeren om knock-out de ZmCCR1 gen. Twee primer sets zijn ontworpen om twee fragment segmenten van ZmCCR1 cDNA versterken:. Een 523 bp fragment van nucleotide 748-1271, en ​​een 285 bp fragment van nucleotide 986-1271 De ZmCCR1 cDNA werd verstrekt uit de Arizona Genome Institute (A…

Representative Results

We hebben een vermindering van het lignine-gehalte in maïsplanten via RNAi aangetoond. Het met deeltjes transformatiewerkwijze leverde ongeveer 30% trnasformation rendement. De gene silencing van ZmCCR1 werd consistent waargenomen in T0-T2 generaties. De lignine verminderde transgenics groeide op dezelfde wijze als wildtype maïsplanten behalve voor het weergeven van bruine verkleuring in het blad midden-rib, schil en steel. De histologische analyse heeft aangetoond dat het mutante lijnen vertonen een aanzienl…

Discussion

De toegankelijkheid van microbiële cellulasen celwand polysacchariden planten is grotendeels afhankelijk van de mate waarin ze zijn gekoppeld fenolpolymeren ^23. Het succespercentage van lignocellulose biomassa tot fermenteerbare suiker is negatief gecorreleerd met ligninegehalte afgezet in planten secondadry celwanden. Deze correlatie wordt toegeschreven aan de fysische eigenschappen van lignine zoals hydrofobiciteit ^24, chemische heterogeniteit, en het ontbreken van normale hydrolyseerbare interm…

Materials

Media	Chemical compositions
N6OSM	4 g/l N6 salts
(Osmotic medium)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6E	4 g/l N6 salts
(Callus induction)	1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	2.76 g/l proline
	30 g/l sucrose
	100 mg/l casein hydrolysate
	2.5g/l gelrite, pH 5.8.
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
N6S media	4 g/l N6 salts
(Selection media)	1 ml/l N6 vitamin stock
	2 mg/l 2,4-D
	100 mg/l myo-inositol
	0.69 g/L proline
	30 g/L sucrose
	100 mg/L casein hydrolysate
	36.4 g/l sorbitol
	36.4 g/l mannitol
	2.5g/l gelrite, pH 5.8
	Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving
Regeneration medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L (1000X) MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	60 g/L sucrose
	3 g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates)
	Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.
Rooting medium	4.3 g/L MS salts
	1 ml/L MS vitamin stock
	100 mg/L myo-inositol
	30 g/L sucrose
	3g/L gelrite, pH 5.8 (100×25 mm petri-plates).
Specific materials
Screw-top high pressure tubes	Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ
	Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ
10% Neutral buffered formalin	100ml of formalin
(1 liter)	900ml of ddH2O
	4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate
	(NaH2PO4.H2O)
Equipments
Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)
Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)
Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).
HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)
Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)
Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)
JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)
Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL
MA35 Moisture Analyzer; Sartorius
Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)