फ्लो से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की परिभाषित subpopulations साथ nanoparticle बातचीत का विश्लेषण.
इंजीनियर नैनोकणों चिकित्सीय और नैदानिक प्रयोजनों के लिए बहुत आशाजनक गुणों के साथ संपन्न होते हैं. इस काम के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ nanoparticle बातचीत का अध्ययन फ्लो द्वारा विश्लेषण के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है. प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को आसानी से एंटीबॉडी की मध्यस्थता चुंबकीय अलगाव से मानव या माउस ऊतकों से शुद्ध किया जा सकता है. पहले उदाहरण में, एक प्रवाह cytometer में चल रहे अलग सेल आबादी आंतरिक जटिलता सेल सेल से संबंधित आकार के लिए आनुपातिक है जो आगे बिखरे हुए प्रकाश (एफएससी), और एक ओर बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी) द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता. इसके अलावा, विशिष्ट कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के खिलाफ fluorescently लेबल एंटीबॉडी ही नमूना भीतर कई subpopulations की पहचान की अनुमति. कोशिकाओं को अपनी शारीरिक और रूपात्मक राज्य है कि परिवर्तन बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा बढ़ाया जाता है अक्सर, जब इन सभी सुविधाओं के लिए अलग अलग. इधर, 50 एनएम FITC-2 Sio नैनोकणों वीं की पहचान करने के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैंमानव रक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं में nanostructured सामग्री की ई internalization. सेल प्रतिदीप्ति और एक ओर बिखरे हुए प्रकाश वृद्धि नैनोकणों के साथ ऊष्मायन के बाद हमें समय और nanoparticle सेल बातचीत की एकाग्रता निर्भरता को परिभाषित करने की अनुमति दी. इसके अलावा, इस तरह के प्रोटोकॉल प्राथमिक microglia, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त कि उत्परिवर्ती चूहों से अलग साथ rhodamine-2 Sio nanoparticle बातचीत की जांच के लिए बढ़ाया जा सकता है. कोशिकाओं में nanoparticle internalization से संबंधित डेटा confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई है cytometry अंत में, प्रवाह.
इंजीनियर nanomaterials आजकल biomedicine 1 के लिए संभावित अनुप्रयोगों के लिए जीवन वैज्ञानिकों के हित प्रेरणादायक हैं. अकार्बनिक और कार्बनिक पदार्थों की एक विस्तृत विविधता शारीरिक अलग अलग आकार, और रासायनिक विशेषताओं के साथ nanostructures के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन इमारतों में से, गोलाकार आकृति के इंजीनियर नैनोकणों नैदानिक और translational चिकित्सा 2 के लिए महान क्षमता का प्रदर्शन किया. अपने मूल और सतह डिजाइन एक संभव आवेदन के द्वारा संचालित कर रहे हैं और यह nanoparticle संपर्क और बातचीत निम्नलिखित लक्ष्य सेल प्रतिक्रिया का एक गहरा अध्ययन निकलता है. जानबूझकर मानव विषयों को दिलाई माना जाता है कि नैनोकणों प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कई प्रकार के साथ सीधे संपर्क में आ जाएगा. शरीर अखंडता बनाए रखने के लिए उनकी जिम्मेदारी उन्हें nanomedicine 3 में जांच का एक महत्वपूर्ण विषय बना देता है.
सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के सेलुलर हिस्सा मुख्य रूप से फागो द्वारा प्रतिनिधित्व किया हैcytes. उनमें से, monocyte / बृहतभक्षककोशिका वंश केंद्रीय तंत्रिका तंत्र निवासी microglia सहित निकाली गई कोशिकाओं, प्रतिरक्षा रक्षा 4,5 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. वे विदेशी निकायों के साथ सामना करने के बाद कुछ ही घंटों के भीतर सुरक्षा प्रतिक्रियाओं को गति प्रदान करने में सक्षम हैं. इसके अलावा, monocytic कोशिकाओं समन्वय और साइटोकिन्स की रिहाई के माध्यम से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया हिदायत. इन सभी घटनाओं के भी काफी हद तक प्रतिरक्षा प्रणाली 6 से "nonself" के रूप में माना जाता है जो माल इंजीनियर, की उपस्थिति में होते हैं.
ऐतिहासिक रूप से सेल विश्लेषण के लिए इम्यूनोलॉजी में इस्तेमाल किया तरीकों के अलावा, सबसे शक्तिशाली उपकरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है प्रवाह cytometry. इसके अलावा, (अक्सर अपवर्जन या एक ही झिल्ली प्रोटीन की उपस्थिति का शोषण) एक विशिष्ट प्रतिरक्षा subpopulation की पहचान या शोधन के लिए प्रौद्योगिकी की उपलब्धता की अनुमति देता है कि विशेष रूप से प्राथमिक CE पर एक निश्चित nanoparticle के प्रभाव का एक सटीक जांचडालूँगा प्रकार 7. हालांकि, कोशिकाओं नैनोकणों के लिए जोखिम के बाद शारीरिक और रूपात्मक परिवर्तन उपस्थित हो सकता है. साथ ही, नैनोकणों प्राप्त परिणामों 8 को प्रभावित करने, परिभाषित तरंग दैर्ध्य में इस तरह के प्रकाश का अवशोषण या उत्सर्जन के रूप में विशिष्ट ऑप्टिकल मापदंडों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. तो, उपयोग और उपन्यास सामग्री का अध्ययन करने के लिए शास्त्रीय प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के अंतिम रूपांतरों की सीमा पर विचार किया जाना चाहिए.
इस काम के प्रवाह cytometry द्वारा प्राथमिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ nanoparticle बातचीत का पता लगाने का सवाल है. इस मुद्दे के समाधान के लिए, 50 एनएम FITC-2 Sio नैनोकणों विधि का वर्णन करने के लिए एक मॉडल nanomaterial के रूप में कार्यरत थे. सिलिका कणों नैनो मीट्रिक पैमाने में एक बहुत ही सटीक तरीके से उत्पादन किया जा सकता है. इस तरह के आरोप या hydrophobicity के रूप में आकार, आकार, और सतह गुण,, सूक्ष्मता उनके biocompatibility 9 बढ़ाने के लिए देखते जा सकता है. 2 नैनोकणों उन्हें एक के रूप में इस्तेमाल करने की अनुमति दे SiO की कई विशेषताएंदवा वितरण के लिए मॉडल 10 कण. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रंगों या क्वांटम डॉट्स फँस या इमेजिंग प्रयोजनों के लिए 11 उपयोगी नैनो उपकरणों की पेशकश इन कणों से जोड़ा जा सकता है.
प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल ध्यान में रखा जाना करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण बिंदुओं को प्रस्तुत करता है. यह उच्च तापमान और रोशनी नकारात्मक धुंधला उपज को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि सब धुंधला चरणों के दौरान (बर्फ पर) 4 डिग्री सेल्सियस और संभवतः अंधेरे में काम करने के लिए वास्तव में महत्वपूर्ण है. नैनोकणों बेहतर बस का उपयोग करने से पहले resuspended होने के लिए sonicated जा सकता है.
Cytometry विश्लेषण एक सही प्रवाह विभिन्न चैनलों में एक सही अंशांकन की आवश्यकता है. साधन की कैलिब्रेशन हर प्रयोगात्मक सत्र से पहले किया जाना चाहिए. इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ तकनीकी मुद्दों के अलावा, यह भी एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ समस्या हो सकती है. यह एक उपयुक्त एकाग्रता में एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए अनिवार्य है. एकाग्रता बहुत अधिक या बहुत कम है, तो dissatisfying संकेत तीव्रता परिणाम हो सकते हैं.
इस तकनीक चिंता का नुकसान monodisperse नमूनों के साथ काम करने की जरूरत है, असमर्थता स्थानीय बनानासंकेत (यानी विभिन्न सेलुलर डिब्बों) की उत्पत्ति की साइट. संयोजन में इस्तेमाल किया जा fluorochromes के चुनाव में कुछ सीमाएं भी हैं: उत्तेजना और उत्सर्जन बैंड की तरंग दैर्ध्य पर्याप्त उनके उचित माप अनुमति देने के लिए अलग किया जाना चाहिए. इस्तेमाल किया एंटीबॉडी स्पेक्ट्रा ओवरलैप करते हैं, तो एक सही मुआवजा की आवश्यकता है.
प्रवाह cytometry उपस्थिति या नैनोकणों के अभाव में सेल के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. इस तकनीक में एक सेल का एक multiparametric अध्ययन, जांच की घटनाओं का एक उच्च संख्या परमिट, विश्लेषण (1,000 से अधिक कोशिकाओं / सेक), reproducibility और सांख्यिकीय रीडिंग की तीव्रता. नमूने सेल व्यवहार्यता को खोने के बिना संसाधित किया जा सकता है.
Fluorescently लेबल नैनोकणों का उपयोग करके यह कोशिका झिल्ली पर उजागर विशिष्ट मार्करों से पहचाना जाता है जो सेल subpopulations, में उनके internalization अर्हता प्राप्त करने और यों के लिए संभव है. सेल मानकों एस की उपस्थिति में बदल सकते हैं pecific नैनोकणों. अनुसंधान के उद्देश्य पर निर्भर करता है, इन बदलावों ऐसे आनुपातिक बढ़ती nanoparticle internalization दर के साथ बढ़ जाती है कि कोशिकाओं की ओर बिखरने के रूप में, एक विशिष्ट घटना की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
कोशिका की सतह के nanoparticle प्रेरित संशोधनों भी तकनीक की एक सीमा का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. इस कारण से, कोशिका झिल्ली रिसेप्टर्स कारोबार हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए और संभवतः ठीक ब्याज की सेल की आबादी को चिह्नित करने के लिए अग्रिम में जाना जाता है. Nanoparticle अतिभारित नमूनों में झिल्ली असमस की चरम impairments सेल मौत का कारण हो सकता है.
Nanomaterial खुराक पर निर्भर विषाक्तता अनुभव से प्रत्येक सेल की आबादी के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. स्पष्ट रूप से परिभाषित मृत कोशिकाओं प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव से बाहर रखा जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, Annexin वी / पीआई धुंधला आमतौर पर परिगलित और apoptotic दोनों कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल कई तरीकों में से एक है.
"> GFP-व्यक्त प्राथमिक कोशिकाओं को भी एक निश्चित सेल subpopulation का चयन करें और prelabeling बिना डेटा एकत्र करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. पूरक फ्लोरोसेंट नैनोकणों के साथ संयोजन सेल nanoparticle बातचीत का एक बहुत तेजी से और सटीक मात्रा का ठहराव. दवा या जीन डिलीवरी के लिए सोचा है की अनुमति देता है चयनित ऊतकों में एक विशेष दवा भार जारी करने में सक्षम नैनोकणों के आवेदन के द्वारा भविष्य में सुधार किया.नैनोकणों औषधी के रूप में वितरण वाहक विशिष्ट और / या प्रतिरक्षा modulators के रोजगार सेल nanoparticle बातचीत का अध्ययन करने के लिए जैविक पर्यावरण का ज्ञान (यानी फ्लो के माध्यम से) की आवश्यकता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम Fondazione Istituto इतालवी di Tecnologia द्वारा समर्थित किया गया.
लेखक इस पांडुलिपि के प्रायोजन के लिए Miltenyi बायोटेक GmbH (Bergisch Gladbach, जर्मनी) स्वीकार करना चाहते हैं, डा. पाओलो Petrucciani मानव Buffy कोट प्रदान करने के लिए (इम्यूनो रुधिर विज्ञान और आधान सेवा, अस्पताल Lotti Pontedera, पीसा, इटली विभाग) और प्रो मास्सिमो Pasqualetti (जीवविज्ञान विभाग – सेलुलर की यूनिट और विकास जीवविज्ञान, पीसा, पीसा, इटली के विश्वविद्यालय) के आवास के लिए माउस कॉलोनी.
HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |