Analyse av nanopartikler interaksjon med definerte subpopulasjoner av immunceller av flowcytometri.
Nanopartikler er utstyrt med svært lovende egenskaper for terapeutiske og diagnostiske formål. Dette arbeid beskriver en rask og pålitelig metode for analyse ved strømningscytometri for å studere nanopartikkel interaksjon med immunceller. Primære immunceller kan lett renset fra humane eller mus vev etter antistoff-mediert magnetisk isolasjon. I det første eksempel, kan de forskjellige cellepopulasjoner som kjører i et strømningscytometer skilles ved frem-spredte lyset (FSC), som er proporsjonal med cellestørrelse og sidespredt lys (SSC), relatert til celle indre kompleksitet. Videre fluorescensmerkede antistoffer mot spesifikke celleoverflatereseptorer tillate identifisering av flere subpopulasjoner i den samme prøven. Ofte, alle disse funksjonene varierer når cellene blir styrket av ytre stimuli som endrer deres fysiologiske og morfologiske tilstand. Her, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikler er brukt som modell for å identifisere the internalisering av nanostrukturerte materialer i humane blodimmunceller. Cellen fluorescens og side-spredt lys økning etter inkubasjon med nanopartikler tillatt oss å definere tid og konsentrasjon avhengighet av nanopartikkel-celle interaksjon. Videre kan en slik protokoll bli utvidet til å undersøke Rhodamin-SiO 2 nanopartikkel samhandling med primær microglia, sentralnervesystemet bosatt immunceller, isolert fra muterte musene som spesifikt uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i monocytter / makrofager avstamning. Endelig strømningscytometri data relatert til nanopartikkel internalise inn i cellene har blitt bekreftet ved konfokal mikroskopi.
Konstruerte nanomaterialer er i dag inspirerende interesse av livet forskere for potensielle søknader til biomedisin en. En lang rekke uorganiske og organiske materialer kan brukes til å produsere nanostrukturer med forskjellige former, fysiske og kjemiske egenskaper. Blant disse strukturene, konstruerte nanopartikler av sfærisk form viste stort potensial for diagnostisk og translasjonell medisin to. Deres kjerne og overflate-utforming er drevet av en mulig anvendelse, og det innebærer en dyp undersøkelse av mål-celle responser etter nanopartikkel kontakt og interaksjon. Nanopartikler som er tenkt å være bevisst gis til mennesker vil komme i direkte kontakt med flere typer immunceller. Deres ansvar å opprettholde kroppens integritet gjør dem et avgjørende tema for etterforskningen i nanomedisin tre.
Den cellulære delen av det medfødte immunsystemet er i hovedsak representert ved PHAGOcytes. Blant dem, monocytter / makrofag avstamning avledet celler, inkludert det sentrale nervesystemet bosatt mikroglia, spille en sentral rolle i immunforsvaret 4,5. De er i stand til å utløse en beskyttende immunrespons innen få timer etter møter med fremmedlegemer. Videre monocyttisk celler koordinere og instruere adaptive immunrespons gjennom utgivelsen av cytokiner. Alle disse hendelsene inntreffer selv i nærvær av konstruerte materialer, som i stor grad oppfattes som "nonself" av immunsystemet seks.
Blant metodene som historisk sett benyttet i immunologi for celleanalyse, strømningscytometri representerer en av de mest kraftfulle verktøy. Videre tillater tilgjengeligheten av teknologier for identifikasjon eller rensing av en spesifikk immun subpopulasjon (ofte å utnytte utelukkelse eller tilstedeværelsen av en enkelt membranprotein) en nøyaktig undersøkelse av effekten av et bestemt nanopartikler på det aktuelle primære cell type 7. Imidlertid, celler kan presentere fysiologiske og morfologiske forandringer etter eksponering for nanopartikler. I tillegg, kan nanopartiklene interferere med bestemte optiske parametere, for eksempel absorpsjon og emisjon av lys ved bølgelengder som er definert, å påvirke de oppnådde resultater 8. Derfor bør rammen av bruk og eventuelle tilpasninger av klassiske immunologiske assays til studiet av nye materialer tas i betraktning.
Dette arbeidet dreier seg om påvisning av nanopartikkel interaksjoner med primære immunceller ved strømningscytometri. For å løse dette problemet, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikler ble ansatt som en modell nanomaterial å beskrive metoden. Silikapartikler kan fremstilles på en meget nøyaktig måte i nano-metriske akse. Størrelse, form og overflateegenskaper, for eksempel kostnad eller hydrofobisiteten, kan finjusteres for å øke sin biokompatibilitet ni. Mange trekk ved SiO 2 nanopartikler tillater dem å bli brukt som enmodell for levering av legemidler partikler 10. Videre kan fluorescerende farger eller kvanteprikker bli fanget, eller knyttet til disse partiklene som tilbyr nyttige nano-verktøy for bildebehandling formål 11.
Den eksperimentelle protokollen presenterer svært viktige poeng for å bli tatt i betraktning. Det er veldig viktig å jobbe ved 4 ° C (på isen) og muligens i mørket under alle flekker trinnene, fordi høyere temperatur og lys kan negativt påvirke farging yield. Nanopartikler kan bli sonikert for å bli bedre resuspendert like før bruk.
En riktig strømningscytometri-analyse krever en korrekt kalibrering i de forskjellige kanaler. Kalibrering av instrumentet bør utføres før hver eksperimentell økt. Foruten tekniske problemer med instrumentering, kan det også være problemer med antistoff merking. Det er obligatorisk å benytte antistoff i en passende konsentrasjon. Hvis konsentrasjonen er for høy eller for lav, kan dissatisfying signalintensitetene være konsekvensen.
Ulempene med denne teknikken bekymring behovet for å jobbe med monodisperse prøver, manglende evne lokalisereopprinnelsesstedet på signalet (dvs. forskjellige cellene). Det er også noen begrensninger i valg av fluorokromer som skal brukes i kombinasjon: bølgelengden til eksitasjon og emisjonsbånd må være tilstrekkelig adskilt for å tillate deres aktuelle måling. Dersom de benyttes antistoff spektra overlapper hverandre, er en korrekt kompensasjon nødvendig.
Strømningscytometri er en kraftig metode for celle-analyse i nærvær eller fravær av nanopartikler. Denne teknikk tillater en multiparametric studie av en celle, et høyt antall hendelser undersøkt, hurtigheten i analysen (mer enn 1000 celler / sek), reproduserbarhet og statistiske målinger. Prøver kan bli behandlet uten at celle-levedyktighet.
Ved hjelp av fluorescensmerkede nanopartikler er det mulig å kvalifisere og kvantifisere deres internalisering i celle subpopulasjoner, som er identifisert ved spesifikke markører eksponert på cellemembranen. Celleparametre kan endre seg i nærvær av s Pecific nanopartikler. Avhengig av målet for undersøkelser, kan disse variasjoner bli brukt for å identifisere et bestemt fenomen, slik som side-spredning av celler som øker proporsjonalt med den økende nanopartikkel internalise hastighet.
Nanopartikkel-induserte modifikasjoner av celleoverflate kan også representere en begrensning av teknikken. Av denne grunn må cellemembranreseptorer omsetningen blir alltid tas i betraktning, og eventuelt er kjent på forhånd for å karakterisere nøyaktig cellepopulasjonen av interesse. Ekstreme nedskrivninger av membran osmose i nanopartikkel belastet prøvene kan føre til celledød.
Nanomaterial doseavhengige toksisitet bør empirisk testet for hver cellepopulasjon. Klart definerte døde celler må utelukkes fra fluorescens kvantifisering. For eksempel er Annexin V / PI farging av en av flere metoder som vanligvis brukes til å detektere både nekrotiske og apoptotiske celler.
"> GFP-uttrykke primære celler er også et kraftig verktøy for å velge en bestemt celle undergruppe og samle data uten prelabeling. Kombinasjonen med komplementære fluorescerende nanopartikler gir en meget rask og presis kvantifisering av celle-nanopartikkel interaksjon. Drug eller genet levering er antatt å bli forbedret i fremtiden ved anvendelse av nanopartiklene i stand til å frigi en bestemt medikamentbelastning til utvalgte vev.Ansettelse av nanopartikler som bestemte leverings bærere og / eller immun modulatorer for farmasi krever kunnskap om det biologiske miljøet (dvs. gjennom flowcytometri) for å studere celle-nanopartikkel interaksjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia.
Forfatterne ønsker å takke Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Tyskland) for sponsing av dette manuskriptet, Dr. Paolo Petrucciani (Department of Immuno-hematologi og transfusjonstjenesten, sykehus Lotti Pontedera, Pisa, Italia) for å gi menneske buffy coats og Prof Massimo Pasqualetti (Institutt for biologi – Enhet for Cellular and Developmental Biology, University of Pisa, Pisa, Italia) for boliger musekoloni.
HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |