Analys av nanopartiklar interaktion med definierade subpopulationer av immunceller genom flödescytometri.
Nanopartiklar är utrustade med mycket lovande egenskaper för terapeutiska och diagnostiska ändamål. Detta arbete beskriver en snabb och tillförlitlig metod för analys genom flödescytometri för att studera nanoparticle samspel med immunceller. Primära immunceller kan lätt renas från humana eller mus-vävnader genom antikroppsmedierad magnetisk isolering. I första hand, kan de olika cellpopulationer som körs i en flödescytometer särskiljas genom den framåt spritt ljus (FSC), som är proportionell mot cellstorlek och sido spritt ljus (SSC), relaterade till cell interna komplexitet. Dessutom fluorescerande antikroppar mot specifika receptorer på cellytan det möjligt att identifiera flera subpopulationer inom samma prov. Ofta, alla dessa funktioner varierar när celler förstärks av yttre stimuli som förändrar deras fysiologiska och morfologiska tillstånd. Här, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartiklar används som en modell för att identifiera: ee internalisering av nanostrukturerade material i människoblodimmunceller. Cell fluorescens-och sido spritt ljus ökning efter inkubation med nanopartiklar tillät oss att definiera tid och koncentrationsberoende interaktion nanopartikel-cell. Dessutom kan ett sådant protokoll utvidgas till att undersöka Rhodamine-SiO 2 nanopartiklar interaktion med primär mikroglia, det centrala nervsystemet bosatta immunceller, isolerad från muterade möss som specifikt uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) i monocyter / makrofager härstamning. Slutligen, flödescytometri uppgifter om nanopartiklar interna in i cellerna har bekräftats av konfokalmikroskopi.
Konstruerade nanomaterial är numera inspirerande intresse livforskare för potentiella applikationer till biomedicin 1. Ett stort antal olika oorganiska och organiska material kan användas för att framställa nanostrukturer med olika former, fysikaliska och kemiska egenskaper. Bland dessa strukturer, nanopartiklar av sfärisk form visat stor potential för diagnostik och translationell medicin 2. Deras kärna och yta design drivs av en eventuell ansökan och det innebär en djupgående studie av mål-cellssvar efter nanopartiklar kontakt och samspel. Nanopartiklar som tros vara avsiktligt ges till människor och som kommer att komma i direkt kontakt med flera olika typer av immunceller. Deras ansvar för att upprätthålla kroppsintegritet gör dem till en viktig ämne för utredning i nanomedicin 3.
Den cellulära delen av det medfödda immunförsvaret är främst representerat av phagocyter. Bland dem, monocyten / makrofag härstamning härledda celler, inklusive det centrala nervsystemet bosatta mikroglia, spelar en viktig roll i immunförsvaret 4,5. De kan utlösa skyddande svar inom några timmar efter att ha mött med främmande föremål. Dessutom är de monocytiska celler samordna och instruera det adaptiva immunsvaret genom frisättning av cytokiner. Alla dessa händelser inträffa även i närvaro av framtagna material, som till stor del uppfattas som "nonself" av immunsystemet 6.
Bland de metoder som historiskt använts i immunologi för cellanalys, flödescytometri representerar en av de mest kraftfulla verktyg. Dessutom möjliggör tillgången på teknik för identifiering eller rening av ett specifikt immun subpopulation (ofta utnyttja undantag eller närvaron av en enda membranprotein) en noggrann undersökning av effekterna av en viss nanopartikel på just den primära cell typ 7. Emellertid kan cellerna presentera fysiologiska och morfologiska förändringar efter exponering för nanopartiklar. Vad bra, kan nanopartiklar störa specifika optiska parametrar, såsom absorption eller emission av ljus vid definierade våglängder, att påverka de erhållna resultaten 8. Så, begränsningar för användning och eventuella anpassningar av klassiska immunologiska analyser för att studera nya material bör övervägas.
Detta arbete avser detektion av nanopartiklar interaktioner med primära immunceller genom flödescytometri. För att behandla denna fråga, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartiklar användes som modell nanomaterial för att beskriva metoden. Kiseldioxidpartiklar kan framställas på ett mycket exakt sätt i nanometrisk skala. Storlek, form och ytegenskaper, såsom laddning eller hydrofobicitet, kan finjusteras för att öka deras biokompatibilitet 9. Många funktioner i SiO 2 nanopartiklar gör att de kan användas som enmodell för läkemedelstillförsel partiklar 10. Dessutom kan fluorescerande färger eller kvantprickar infångas eller kopplas till dessa partiklar som erbjuder användbara nanoverktyg för avbildningsändamål 11.
Den experimentella protokollet presenterar mycket viktiga punkter som skall beaktas. Det är verkligen viktigt att arbeta vid 4 ° C (på is) och eventuellt i mörker under alla färgningssteg, eftersom högre temperaturer och ljus kan påverka färgning avkastningen negativt. Nanopartiklar kan sonikeras vara bättre suspenderas strax före användning.
En korrekt flödescytometrianalys kräver en korrekt kalibrering av de olika kanalerna. Kalibrering av instrumentet ska utföras före varje experimentell session. Förutom tekniska problem med instrumenteringen, kan det också finnas problem med märkningen kroppen. Det är obligatoriskt att använda antikroppen i en lämplig koncentration. Om koncentrationen är för hög eller för låg, kan dissatisfying signalintensitet bli följden.
Nackdelarna med denna teknik berör behovet av att arbeta med monodispersa prover, oförmågan att lokaliseraplats varifrån signalen (dvs. olika cellulära fack). Det finns också vissa begränsningar i valet av fluorokromer som kan användas i kombination: våglängden för excitation och emissionsbanden måste vara tillräckligt åtskilda för att tillåta deras lämplig mätning. Om de används spektra antikroppslappar varandra, är en riktig ersättning krävs.
Flödescytometri är en kraftfull metod för cellanalys i närvaro eller frånvaro av nanopartiklar. Denna teknik medger en multiparameter studie av en cell, ett högt antal händelser undersöktes, snabbheten i analys (mer än 1000 celler / sek), reproducerbarhet och statistiska avläsningar. Proverna kan processas utan att förlora cellviabilitet.
Genom att använda fluorescerande nanopartiklar är det möjligt att kvalificera och kvantifiera deras internalisering i cellpopulationer, som identifieras av specifika markörer som exponeras på cellmembranet. Cell parametrar kan ändras i närvaro av s ÄRSKILDA nanopartiklar. Beroende på syftet med forskningen, kan dessa variationer användas för att identifiera en specifik företeelse, till exempel sido spridning av celler som proportionellt ökar med den ökande nanopartiklar interna takt.
Nanopartiklar-inducerade modifieringar av cellytan kan också representera en begränsning av tekniken. Därför måste cellmembranreceptorer omsättning ska alltid tas i beaktande och eventuellt kända i förväg att exakt karakterisera cellpopulationen av intresse. Extrema nedskrivningar av membran osmos i nanopartiklar överbelastad prover kan leda till celldöd.
Nanomaterial dosberoende toxicitet bör empiriskt för varje cellpopulation. Klart definierade döda celler måste uteslutas från fluorescens kvantifiering. Till exempel är Annexin V / PI-färgning en av flera metoder som vanligen används för att detektera både nekrotiska och apoptotiska celler.
"> GFP-uttryckande primära celler är också ett kraftfullt verktyg för att markera en viss cell subpopulation och samla in data utan prelabeling. Kombinationen med kompletterande fluorescerande nanopartiklar ger en mycket snabb och exakt kvantifiering av cell-nanopartiklar interaktion. Drog eller gentillförsel tros förbättras i framtiden genom tillämpning av nanopartiklar kan släppa en viss läkemedelsbelastning i utvalda vävnader.Employment av nanopartiklar som specifika leverans bärare och / eller immunmodulatorer för farmaci kräver kunskap om den biologiska miljön (dvs. genom flödescytometri) för att studera cell-nanopartikelinteraktioner.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia.
Författarna vill tacka för Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Tyskland) för sponsring av detta manuskript, Dr Paolo Petrucciani (Institutionen för Immun hematologi och transfusions service, sjukhus Lotti Pontedera, Pisa, Italien) för att ge humana buffy coats och Prof. Massimo Pasqualetti (Institutionen för biologi – Enheten för Cell-och utvecklingsbiologi, Universitetet i Pisa, Pisa, Italien) för bostäder musen kolonin.
HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |