Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 mariner transposon-mediert mutagenese for å generere en høy tetthet innsetting mutant bibliotek til skjermen, isolere og identifisere nye alginat regulatorer i prototypic Pseudomonas aeruginosa belastning PAO1.
Pseudomonas aeruginosa er en gram-negativ, miljø-bakterie med allsidige metabolske funksjoner. P. aeruginosa er en opportunistisk bakteriell patogen som etablerer kroniske lungeinfeksjoner hos pasienter med cystisk fibrose (CF). Den overproduksjon av et kapsulært polysakkarid kalt alginat, også kjent som mukoiditet, fremmer dannelsen av slimaktig biofilmer som er mer motstandsdyktig enn planktoniske celler til antibiotikum kjemoterapi og vertens forsvar. I tillegg er konvertering fra ikke-mukoid til slimaktig fenotype en klinisk markør for utbruddet av kronisk infeksjon i CF. Alginat overproduksjon av P. aeruginosa er en endergonic prosess som tungt skatter cellulær energi. Derfor er alginat produksjon sterkt regulert i P. aeruginosa. For bedre å forstå alginat regulering, beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 transposon mutagenese for identifisering av romanen alginat regulators i en prototypic belastning PAO1. Fremgangsmåten består av to grunnleggende trinn. Først, vi overførte mini-himar1 transposon (pFAC) fra verts E. coli SM10/λpir til mottaker P. aeruginosa PAO1 via biparental konjugering å skape en høy tetthet innsetting mutant bibliotek, som ble valgt på Pseudomonas isolasjon agar plater supplert med gentamycin. Dernest, vi skjermet og isolert de slimaktig koloniene å kartlegge innstikkstedet gjennom invers PCR ved hjelp av DNA-primere som peker utover fra gentamycin kassett og DNA-sekvensering. Ved hjelp av denne protokollen, har vi identifisert to nye alginat regulatorer, mucE (PA4033) og kinB (PA5484), i belastning PAO1 med en villtype muca koding av anti-sigma faktor muca for master alginat regulator AlgU (AlgT, σ 22) . Denne high-throughput mutagenese Protokollen kan modifiseres for identifisering av andre virulens-relaterte gener som forårsaker endring i coloNY morfologi.
Muligheten av opportunistiske, gram-negative patogene Pseudomonas aeruginosa for å overprodusere alginat er en viktig faktor i sin evne til å etablere en biofilm. Overproduksjon av alginat er en fenotype ofte referert til som mukoiditet. Isolasjon av slimaktig kolonier fra sputa av personer rammet av cystisk fibrose (CF) er et tegn på en kronisk infeksjon, og er direkte forbundet med en samlet nedgang i pasientens helse en. Foreløpig er det enighet om at regulering og produksjon av alginat i P. aeruginosa oppstår hovedsakelig på to operoner. Den første er den alginat biosyntetiske operon, som inneholder 12 gener (algD – alg8 – alg44 – algK – Alge – algG – algX – algL – ALGI – algJ – algF – alge) som er ansvarlig for syntese og eksport av alginat polymer tvers periplasma til ekstracellulære environment 2-5. Den andre operon er en klynge av gener som begynner med den alternative sigma faktoren algU / T og fortsetter med muca, mucB, og mucD. AlgU / T er en positiv regulator, mens MucAB-D er klassifisert som negative regulatorer av alginat produksjon 6-8. I tillegg transcriptional regulator, slik som AlgB, AlgQ, AlgR og RpoN, samt post-transkripsjonelle og post-translasjonell modifikasjon av catabolite undertrykkelse kontroll, kinaseaktivitet (KinB) og intramembrane proteolyse, har også vist seg å være involvert i alginat regulering 9-14.
Den mini-himar1 transposon vektor kjent som pFAC ble opprinnelig opprettet i Dr. Mekalanos 'lab ved Harvard Medical School 15. Den pFAC plasmidet består av et transportabelt element som flankert av to inverterte gjentagelser av 27 bp og en gentamycin motstand kassett i midten (aacC1: 534 bp), et gen som koder for hyperactive mariner transposase 16, og et gen som koder for β-laktamase (bla) (figur 1). Sekvensinformasjon for den transposable element av pFAC er tilgjengelig på GenBank sjonsnummer: DQ366300 13. I pFAC, er det et multippel kloningssete (MCS) bak aacC1-genet som anvendes for identifisering av det kromosomale innføringsstedet ved hjelp av invers PCR. En stor fordel med å bruke mini-himar1 transposon er ingen spesifikke vertsfaktorer er nødvendig for innarbeiding (mutagenese). I tillegg er høy mengde av TA-dinukleotid innstikk finnes i hele genomet av P. aeruginosa. For eksempel, TA dinucleotide innstikk oppstår 94404 og 100229 ganger i PAO1 (6264404 bps, GenBank tiltredelse nummer NC_002516.2) og PA14 (6537648 bps, GenBank tilgang nummer NC_008463) genomer, henholdsvis. På grunn av overflod av TA dinucleotide i genomet, mini-himar1 </em> Transposon kan føre til høy tetthet og tilfeldig mutagenese, som er spesielt egnet for analyse av gener virulens og de gener som er sterkt regulert. Teoretisk kan det mini-himar1 transposon sette inn noen unødvendige gen innenfor genomet til P. aeruginosa. Dette gir ca 18 TA innstikk pr åpen leseramme i PAO1 genomet.
Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 transposon-mediert mutagenese å identifisere nye regulatorer av mukoiditet i P. aeruginosa. Mer spesifikt, vi biparentally konjugert den pFAC vektor som inneholder en mini-himar1 transposon fra E. coli SM10/λpir inn i ikke-mukoid proto belastning PAO1. Etter at transposon er integrert i genomet, er belastningen mottaker dyrket på Pseudomonas isolasjon agar (PIA) som inneholder triclosan som hemmer veksten av E. coli. Således, et bibliotek av mutanter av <em> P. aeruginosa kan velges av veksten på PIA plate supplert med gentamycin og tilstedeværelsen av slimaktig fenotype. Obs, en sann transposon-mediert vs en integrasjon mutant vil ha en gentamycin motstandsdyktig og Carbenicillin følsomme fenotype. I denne studien ble ca 80000 innsetting mutanter av PAO1 isolert gjennom fire separate bøyning. Vi deretter screenet for slimaktig isolater, og fast bestemt på stedet av innsetting av restriksjonsenzym fordøyelse, ligering og invers PCR. Vi utførte Southern blot-analyse ved bruk av gentamycin motstands kassetten som en probe for å se hvor mange innsettings per genom. Vi fastslått at mer enn 90% av mutanter innhentet per konjugering ved hjelp av denne protokollen hadde bare ett eksemplar av himar1 i genomet og vises den gentamycin motstandsdyktig og Carbenicillin følsomme fenotype. Totalt 32 slimaktig isolatene ble identifisert, 22 av dem ble kartlagt til forskjellige loci av P. aeruginosa PAO1kromosom. Denne prisen av innsetting gir tilstrekkelig dekning for å identifisere flere nye regulatorer av alginat overproduksjon.
Det er viktig å merke seg at denne metoden kan anvendes i andre Pseudomonas-arter med følgende forandringer: inkuber P. fluorescens og P. putida ved 30 ° C, og P. stutzeri ved 42 ° C; P. stuzeri skal dyrkes på LB-plater supplert med 150 pg / ml gentamycin, på trinnet 1.11, P. stutzeri cellene skal bli overført inn i 500 pl av LB i stedet for 1 ml. I tillegg er det to viktige skritt for denne protokollen. Først bør belastningen mottaker dyrkes ved passende te…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), Cystisk fibrose Foundation (CFF-YU11G0) og NIH P20RR016477 og P20GM103434 til West Virginia ideen Nettverk for Biomedical Research Excellence. Vi takker Vonya M. Eisinger for hjelp i forbindelse med dette arbeidet.
Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |