Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Summary

Descrevemos a dissecção e ex vivo cultura de rato pele embrionária. O sistema mantém uma cultura de interface ar-líquido através da superfície do tecido e permite imagens em um microscópio invertido. Melanoblastos, um componente da pele em desenvolvimento, são marcadas por fluorescência, permitindo o seu comportamento a ser observada por meio de microscopia confocal.

Abstract

Melanoblastos são a crista neural precursores de melanócitos derivados; as células responsáveis ​​pela produção do pigmento na pele e no cabelo. Melanoblastos migra através da epiderme do embrião onde subsequentemente colonizar o cabelo desenvolver folículos ^1,2. Migração das células da crista neural é amplamente estudada in vitro, mas em métodos in vivo ainda não estão bem desenvolvidos, especialmente em sistemas de mamíferos. Uma alternativa é a utilização ex vivo de cultura organotípica ^3-6. Cultura de rato embrionário pele requer a manutenção de uma interface ar-líquido (ALI) em toda a superfície do tecido ^{de 3,6.} Alta resolução de imagem de live-rato pele embrionária tem sido dificultada pela falta de um bom método que não só mantém este ALI, mas também permite que a cultura seja invertida e, portanto, compatível com lentes objetivas de distância de trabalho curta e microscópios mais confocal. Este artigo descreve as recentes melhorias para a metanfetaminaod que utiliza uma membrana permeável a gás para superar estes problemas e permitir alta resolução de imagem confocal de pele embrionário em cultura ex vivo ^6. Ao utilizar um melanoblasto específica Cre-recombinase expressa linha de rato combinado com a linha de repórter R26YFPR que são capazes de marcar por fluorescência da população melanoblasto dentro destas culturas de pele. A técnica permite ao vivo de imagem de melanoblastos e observação de seu comportamento e interações com o tecido em que se desenvolvem. Os resultados representativos são incluídos para demonstrar a capacidade de viver-imagem seis culturas em paralelo.

Introduction

Tradicionalmente pele embrionária foi cultivada por dissecar a partir do embrião do rato e montagem em uma membrana de policarbonato Nuclepore. A membrana é então lançada em meio de cultura, mantendo, assim, uma interface ar-líquido através da superfície do tecido em desenvolvimento ^3,4. Esta técnica tem sido utilizada para avaliar o comportamento melanoblasto pela fixação do tecido e a avaliação de distribuição melanoblasto usando β-galactosidase como marcador ^7. Nós desenvolvemos um método que permite melanoblastos live-imaging de fluorescente etiquetado em ex vivo cultura pele ^6. Aqui vamos descrever o método em detalhes de dissecação, a configuração, a viver de imagem confocal e incluem algumas melhorias recentes.

Melanoblastos são os precursores embrionários dos melanócitos, as células que produzem o pigmento no cabelo e na pele. Melanoblastos surgem na crista neural adjacente ao tubo neural embrionária por volta do dia 9 (E9) no rato em desenvolvimento embryo. Subsequentemente migram ao longo de um percurso entre a dorsolateral ectoderme e somitos desenvolvimento. No E12.5 eles se movem da derme para a epiderme, onde proliferam e continuar sua migração. O padrão primário folículo piloso começa a se formar na epiderme em E14.5 e E15.5 por melanoblastos está localizando a esses folículos. Para uma revisão do desenvolvimento melanoblasto / melanócito ver Thomas & Erickson (2008) ^1. A fim de marcar a população melanoblasto combinamos Tyr :: CREB animais que expressam Cre-recombinase, conduzido pelo promotor de rato de tirosinase com ⁸ animais R26YFPR que expressam a proteína fluorescente amarela (YFP) condicionalmente a partir do locus Rosa26 ^9.

Nós descrevemos um método para cultura da pele e capturar imagens embrionárias usando um microscópio confocal invertido. É adaptado forma do método original descrito em Mort et al. (2010) ^6. O presentemétodo permite a formação de imagens de um formato de 6 poços e elimina a dependência de membranas Nuclepore e em matrigel para suportar a cultura. Em vez disso, utilizando um pequeno bloco de agarose a 1% para estabilizar a pele embrionário. Removendo a dependência de matrigel é importante, especialmente em situações em que a resposta da pele embrionário a factores de crescimento solúveis é o foco de estudo. Nosso método original já foi usado para ganhar novos insights sobre o desenvolvimento melanoblasto ^10-13 e nós antecipamos que as melhorias que descrevemos aqui vai torná-lo mais poderoso como uma técnica experimental, especialmente onde várias culturas paralelas são uma exigência.

Protocol

Todo o trabalho animal foi executada de acordo com as diretrizes institucionais sob licença pela UK Home Office (número de licença do projeto PPL 60/3785 e 60/4424). 1. Preparação Identifique os melanoblastos na pele em desenvolvimento, combinando uma linha de expressar rato Cre-recombinase apropriado com uma linha de rato repórter fluorescente. :: CreA Tyr, Tyr :: CREB 8 e Wnt1 :: Cre 14 têm sido utilizados com sucesso como linhas de…

Representative Results

A Figura 2 mostra resultados representativos de um experimento de lapso de tempo usando pele embrionária de Tyr :: CREB x embriões R26YFPR em E14.5. 6 culturas de pele embrionários foram fotografadas por microscopia confocal a cada 2 min durante 18 horas. O pacote ImageJ software de análise de imagem gratuito foi usado para analisar o comportamento dos melanoblastos YFP-rotulados nos 6 filmes. Os melanoblastos foram automaticamente rastreados usando o plugin wrMTrck desenvolvido po…

Discussion

Nós descrevemos um método para a cultura da pele embrionária que é particularidade passíveis de imagem de células vivas para a microscopia confocal invertidos. O método inclui os melhoramentos recentes que permitem seis culturas a ser trabalhada em paralelo e elimina a dependência de matrigel e membranas Nuclepore do método original ^6. A diferença fundamental técnica a partir de técnicas similares é a utilização de uma membrana permeável ao gás lummox para estabelecer uma interface líquido d…

Materials

DMEM high glucose	Biochrom AG	F0475	without phenol red
Penicillin	Sigma	P3032
Streptomycin	Sigma	S9137
Fetal calf serum	Hyclone	SV30160.03
Glutamax	Gibco	35050-038
Ethanol	Generic
Live imaging chamber	Custom made
Lummox dishes	Sarstedt	94.6077.410
6-well plate	Greiner Bio-One	657-160
Single edged razor blade	Fisher Scientific	1244-3170
Agarose	Biogene	300-300
Fine pastette	Generic
PBS	Generic
Kebab skewers	Waitrose		Bamboo BBQ skewers 30cm
Toothbrush	Generic
Petri dishes	Greiner Bio-One	633185
Suture thread	Look	SP115	Black silk suture thread