Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Summary

In-vitro-Kultur haben Systeme unerlässlich, um unser Verständnis von Wirbel myogenesis bewährt. Allerdings bleibt noch viel zu über Nicht-Säuger-Skelettmuskel-Entwicklung und das Wachstum gelernt werden, vor allem in den basalen Taxa. Eine effiziente und robuste Protokoll für die Isolierung der adulten Stammzellen aus diesem Gewebe, die myogene Vorläuferzellen (MPCs) und Erhaltung ihrer Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung in einer Primärkultur Einstellung ermöglicht die Identifizierung von konservierten und unterschiedliche Regulationsmechanismen ganzen die Wirbellinien.

Abstract

Aufgrund der inhärenten Schwierigkeiten und Zeit mit dem Studium der myogenen Programm in vivo beteiligt, Primärkultursysteme von den ansässigen adulten Stammzellen der Skelettmuskulatur abgeleitet, die myogenen Vorläuferzellen (MPCs) sind unverzichtbar für unser Verständnis von Säugetierskelettmuskelentwicklung bewährt und Wachstum. Besonders bei den basalen Taxa der Wirbeltiere sind jedoch begrenzt, die molekularen Mechanismen, die die Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung von MPC Beschreibung von Daten. Von besonderem Interesse sind mögliche Mechanismen, die die Fähigkeit der basalen Wirbeltieren zu erheblichen postlarvalen Skelett myofiber Hyperplasie (dh Knochenfische) und die vollständige Regeneration nach Anhängsel Verlust (dh urodele Amphibien) zu unterziehen zugrunde liegen. Zusätzlich könnte die Verwendung von kultivierten Myoblasten im Verständnis der Regeneration und der Wiederholung des myogenen Programm und die Unterschiede zwischen ihnen zu unterstützen. ZuZu diesem Zweck beschreiben wir im Detail ein robustes und effizientes Protokoll (und Variationen) für die Isolierung und die Aufrechterhaltung MPCs und ihre Nachkommen, Myoblasten und Myotuben unreifen, in der Zellkultur als Plattform für das Verständnis der Evolution des myogenen Programm, beginnend mit dem mehr basalen Wirbeltieren. Aufbauend auf der Modellorganismus Status der Zebrafisch (Danio rerio) berichten wir über die Anwendung dieses Protokolls auf kleine Fische des Cyprinidengewässer Clade Danioninae. Parallel kann dieses Protokoll genutzt werden, um eine breitere vergleichenden Ansatz durch Isolierung MPCs aus dem mexikanischen Axolotl (Ambystomamexicanum) und sogar Labornagern zu verwirklichen. Dieses Protokoll wird heute weitgehend in Studium myogenesis in mehreren Fischarten, darunter die Regenbogenforelle, Lachs und Meerbrassen ^4.1 verwendet.

Introduction

Erhebliche Verständnis von Säugetier myogenesis hat durch die Wiederholung dieses Prozesses sowohl in primären Maus (Mus musculus) Myoblasten-Kulturen und die gut beschriebene Maus-abgeleitete Zelllinie gewonnen wurden, C2C12 ^5. Beginnend in den 1950er Jahren ^6, diese Kulturen haben viel Fortschritt im Verständnis der murinemyogenic Programm durch die Erweiterung, myogenesis in anderen Wirbeltieren führte, und. Zusätzlich einzelnen Zelle myofiber Explantat Techniken haben das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Satelliten Muskelfasern ^7-9 für Untersuchungen myogenesis besonders attraktiv aufgrund der kurzen Zeit von Vorläuferzelle ¹⁰ zu unterscheiden, der relativen Leichtigkeit der Transfektion für RNAi erhöht. Zellkulturen ^11-14, transgene ^15,16 und Überexpression Studien ^14,17,18, in-vitro-Expansion, gefolgt von In-vivo-Transplantation ^18-20, und sogar Layoutarison myogener Vorläuferzellen und deren Regel Agenten in Taxa ^21,22. Während die Unterschiede aufgrund der künstlichen Umgebung des Kultursystems beschrieben worden, ^5,23, haben diese in vitro-Systemen nachgewiesen unverzichtbar für unser Dissektion der komplizierten Programm für die Bildung von vielkernigen sein, mononukleären terminal differenzierten myofibersfrom proliferative Vorläuferzellen bekannt myosatellite Zellen (MSC) unter den Säugetieren.

Außerhalb der Klasse Mammalia jedoch die Erhaltung und / oder Divergenz der Mechanismen, die myogenesis schlecht verstanden werden, vor allem wegen der Schwierigkeiten bei der Kultivierung von myogenen Vorläuferzellen (MPCs) und Myoblasten aus verschiedenen Taxa. Tatsächlich haben die Grund Myoblastenkulturen nur in drei Vögel ^24-26, ein Reptil ^27, ein paar Amphibien ^28-30, und einige Fische ^1,3,4,31-33 beschrieben. Kontinuierliche myogenen Zelllinien aus veandere als Nagetiere ^34-36 rtebrates sind noch seltener, nur mit dem Nicht-Säuger myogenen Zelllinie, die aus der japanischen Wachtel (Cortunix japonica) abgeleitet, QM7 ^37. Trotz vieler Versuche der Verewigung, bleibt ein Knochenfisch myogenen Zelllinie schwer zu fassen und ein Protokoll für die effiziente Transfektion dieser Zellen wurde erst in diesem Jahr ¹⁵ veröffentlicht. So sind klar und gut optimierte Protokolle für die Kultivierung von primären Myoblasten MPCs und aus einer Vielzahl von Wirbeltieren sehr notwendig, um nicht nur weiter unser Wissen über die Evolution des myogenen Programm zu erweitern, aber die Macht der vergleichenden Physiologie beschäftigen, um Durchbrüche in machen die Behandlung von menschlichen Skelettmuskelerkrankungen und Störungen.

Während die Literatur enthält viele Berichte von MPC / Myoblasten Isolierung ^38-49, ist es üblich, dass Autoren, die Protokolle für solche Trennungen in kurzen, oft unvollständig, Formate zu beschreiben. Ferner sind die lehrreichsten Protokolle RepoRTED haben für Mäuse ^{von 50 bis 53} entwickelt, und einige von diesen setzen auf Antikörperselektion ^54,55 oder Fluoreszenz Transgene ^56,57, so dass diese Protokolle unbrauchbar oder unpraktisch durch Muskel Biologen genutzt innersten Nicht-Nagetieren. Mit wenig über piscine-, Amphibien-, Reptilien-und Myogenese eine detaillierte und gründliche Protokoll, mit audiovisuellen Führung und mit nachgewiesener Effizienz in entfernt verwandten Arten beschrieben, wäre sehr hilfreich, um das Feld ein.

Zuerst von Powell und Kollegen im Jahr 1989 ⁵⁸ beschrieben, wurde das folgende Protokoll ursprünglich entwickelt, um PLM und Myoblasten aus Salmonidfischen (nämlich, Regenbogenforelle, Oncorhynchus mykiss und Atlantischer Lachs, Salmo salar) und einigen größeren Karpfenfischen (dh Goldfisch, Carassiusauratusauratus) zu isolieren . Im Jahr 2000 Fauconneau Paboeuf und optimiert eine primäre Myoblastenkultur für Regenbogenforelle ⁵⁹ und minoroptimizations made dieses Protokoll nutzbar in mehrere kleinere Elritzen der Danioninae Clade (Zebrafisch, Danio rerio, und riesige Danio, Devario aequipinnatus) ³² aufgrund der vielen genetischen Werkzeuge für die Zebrafisch-Arbeit zur Verfügung und damit seine nahen Verwandten. Knochenfische sind attraktiv für Organismen Studie aufgrund ihrer unterschiedlichen Wachstumsstrategie (zumindest in den meisten Arten). Große Salmoniden, wie die meisten Fische, unbestimmt wachsen, mit Wachstumspotenzial durch eine Asymptote bei Fälligkeit uneingeschränkten, auch im Alter ^60-62. Anders als Zebrafisch, große danionins wie der riesige Danio ⁶³ und Schnurrbart danio Display Wachstum typisch für Knochenfische Potenziale, die ihre direkten Gegenüberstellung zu einer idealen Plattform für das Verständnis, ob MPC Zellschicksal Wahl spielt eine Rolle im Skelettmuskel-Hypertrophie-Hyperplasie gegenüber.

Ebenso haben wir gezeigt, dass dieses Protokoll mit Mäusen und axolotls verwendet werden, wobei relativ hohe Zellausbeute und VIABility Indizes. Urodele Salamander, wie der mexikanische Axolotl (Ambystomamexicanum), besitzen die bemerkenswerte Fähigkeit, Gewebe zu regenerieren, einschließlich ganzer Gliedmaßen und Schwänze ^64-66. Diese Eigenschaft macht diese Amphibien interessante Modelle der Skelettmuskelabbau und Alterung. Mit dem unten beschriebenen Protokoll kann ein ähnlicher Ansatz durchgeführt werden, wie es in vielen Fischarten durchgeführt worden, die eine noch breitere Vergleichs Rahmen für solche Studien. Wie viele wirklich Vergleichs Biologen schätzen, die am sinnvollsten Fortschritte in der Grundlagen der Biologie und translationale Biomedizin ist möglich, wenn Daten innerhalb der breitesten Spektrum analysiert (hier der gesamte Wirbel Linie) werden.

Protocol

Ethikerklärung: Alle hier beschriebenen Experimenten mit Wirbeltieren wurde vorab von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Alabama in Birmingham zugelassen und steht im Einklang mit den Richtlinien des Amtes für Labortierschutz, National Institutes of Health der USA gegründet Department of Health and Human Services. 1. Vorbereitung für Kultur Bereiten Sie das Basismedium wie folgt: 9 mM NaHCO 3 (1,51 g pro 2 l), 20 mM H…

Representative Results

Vierundzwanzig Stunden nach der Aussaat, myogenen Vorläuferzellen (MPCs) sollte sichtbar für das Laminin Substrat befestigt werden (siehe Abbildungen 1a und 1d). Nach der Aussaat, Zellen (MPCs) trifft eine spindelartige Form, bezeichnend für diesen Zelltyp (Abbildung 1) und sind MyoD1 + (Abbildung 2). In Danio Arten, erscheinen MPCs kompakter mit kleineren bipolaren Prozesse als tun MPCs von Oncorhynchus und Salmo-Arten. Do…

Discussion

Myogenen Programms in welcher suchten Spezies, kann am einfachsten durch eine in-vitro-System untersucht werden. In der Tat, nach der Isolierung, myogenen Vorläuferzellen (MPCs) in Fisch oder myosatellite Zellen (MSC) in Säugetieren geben Sie einfach dieses stark regulierten Prozess, der die Proliferation, Zellzyklus-Entzug, und die terminale Differenzierung von Myoblasten und die Fusion von Myoblasten in diesen entstehenden Myotuben. Der allgemeine Mangel an transgenen Reportergens Stämme piscine Arten (mit…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.