このプロトコルは、 ショウジョウバエにおいてlabellar味覚ニューロンによって発射活動電位応答の細胞外記録を記述する。
昆虫の周辺味覚応答は強力な電気生理学的手法を用いて調査することができます。ここで説明する方法は、昆虫の神経系は、その環境における味覚刺激から受ける感覚入力を反映して、研究者が直接かつ定量味覚応答を測定することができます。このプロトコルは、この手法を実行中のすべての重要なステップの概要を説明します。このように必要な機器や記録に適した環境の選択などの電気生理学リグの組み立ての重要なステップは、線引きされています。我々はまた、適切な参照と記録電極を行うことで、記録のために準備する方法について説明し、味物質のソリューション。我々は、詳細に口吻を固定するために、フライにガラス参照電極を挿入することによって昆虫を調製するために使用される方法を記載している。私たちは、砂糖と苦味化合物に反応して味覚ニューロンによって発射電気インパルスの痕跡を示している。プロトコルの態様は、トンであるechnically挑戦し、我々はそのような信号や、システム内の過度のノイズがないこと、および潜在的な解決策として、発生する可能性のあるいくつかの一般的な技術的な課題の広範な記述が含まれています。そのような技術は、時間的に複雑な刺激を送達する送達を刺激する直前に発射背景を観察する、または都合よく水不溶性の味覚化合物を使用できないなどの制約を有する。これらの制限にもかかわらず、(プロトコルで参照マイナーバリエーションを含む)は、この技術は、化合物を味わうために、ショウジョウバエのニューロンの応答を記録するための広く受け入れられた手順の標準です。
味覚は、昆虫は、可溶性の化学物質の広大な範囲を検出することを可能にし、栄養価の高い物質の受け入れに重要な役割、または有害または有毒1の拒絶を果たしている。味はまた、フェロモン1-5を検出することにより、配偶者選択において役割を果たしていると考えられている。これらの重要で多様な機能は、感覚系、環境手がかりを、関連する行動出力に変換する方法に昆虫味覚系調査の説得力のある目標ました。
キイロショウジョウバエの味覚系の主要ユニットは味の毛、または感覚子である。分子は、その先端2,6の細孔を経由して感覚子を入力してください。感覚器は唇弁、脚、翼マージン、および咽頭6に見られる。唇弁に、感覚器の数と位置がステレオタイプされている。ロング(L)、中間(I)、ショート(S:3形態的長さに基づいて、感覚器のクラスがあります。 )7,8を感覚器。各感覚子は2(Iタイプ)または4(L-およびSタイプ)味覚受容ニューロン(GRNs)9のいずれかが含まれます。異なるGRNsは味覚刺激の異なるカテゴリに対応:苦い、砂糖、塩および浸透圧7,10および味覚受容体8,11-13の異なるサブセットを発現する。唯一のIとSタイプの感覚器は苦い応答GRNs 8,10が含まれています。食道下神経節(SOG)へGRNsプロジェクトと味分子によるそれらの活性化は、行動反応6で、その結果、復号化のために、より高い中枢神経系に中継される。ニューロンの比較的少数の分子と行動分析への従順は、 ショウジョウバエの味覚系一般的な味覚システムの調査のための優れたモデルにする。システムは、遺伝的変異またはGAL4-UAS発現システムを介して操作することができる相対的な容易さにも貴重なツール14,15として機能します。
ontent ">これらの感覚器は唇弁の表面から突出しているので、それらは電気生理学のための優れた標的となる。GRNsの焼成は、細胞外記録を用いてモニターすることができる。歴史的には、中に挿入さガラス電極を使用して側壁記録方法ニューロンの活動を記録する感覚子、26が用いられていたが、この方法は実行するのに技術的に困難であり、それは各調製物から長い間記録することが困難であり、その電極と神経細胞の応答を測定する先端記録方法、同時に味物質を提供し、以来、選択肢9,16の方法になっている。これは、 キイロショウジョウバエ 8,10,17,18の味覚系だけでなく、他の昆虫種19〜23の数を調査するために利用されてきた。それが持っている大幅に補償することによって、先端記録方法の主要な欠点の一つを克服tastePROBE増幅器の開発により容易化されてGRN活動電位が過剰に増幅やフィルタリング24ずに記録されることを可能にする基準電極と昆虫感覚子との間に大きな電位差が、。もう一つの重要な開発は、記録電解質25としてtricholineクエン酸を使用することであった。 TCCは浸透圧モル濃度の影響を受けやすいGRNからの応答を抑制し、25を分析する方がはるかに簡単苦いと砂糖味物質によって生成された応答を作り、塩感受性GRNを刺激しない。ここでは、 ショウジョウバエ labellar感覚器の先端記録は現在、カールソンの実験室で行われている方法を説明します。このプロトコルは、ハエを準備する方法は、適当な電気生理学リグを構築する方法を説明しますと、味の録音を実行する方法。我々はこれを使用する際に遭遇する可能性があるショウジョウバエの感覚器のサブセットから録音したいくつかの代表的なデータだけでなく、いくつかの一般的な問題と解決策をも提示テクニック。
Labellar感覚器は、形態学的および解剖学的、組織の違いに記録容易性が異なる。時には感覚子は、任意の味物質に正の応答を誘発することが知られている一つでも応答しない。これが発生する頻度は感覚子種類によって異なります。 L個の感覚器は、最も一貫して応答し、その長さのためにアクセスすることが比較的容易である。一般的には、Sの感覚器は、一貫して応答するが、その短?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、JCに(対RD)NRSA博士号を取得する前の補助金1F31DC012985によっておよびNIHの補助金によって支えられ
私たちは便利技術的なアドバイスのための数値をコンパイルする助けのための原稿、博士ライアンヨセフに有益なコメントを博士リネアワイスに感謝し、博士フレデリックマリオン-POLLだろう。また、4のレビューの有益なコメントに感謝したい。
Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
Retort Stand | generic | ||
Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
Headstage | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
Insulated Electrical Wire | Generic | ||
Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
Aluminum Foil and/or Faraday Cage | Electro-magnetic noise shielding | ||
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
Ice Bucket | Generic | ||
p200 Pipette Tips | Generic | ||
Spinal Needle | Terumo | SN*2590 | |
1ml Syringe | Beckton-Dickenson | 301025 | |
Fly Aspirator | Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh | ||
Modeling Clay | Generic | ||
Forceps | Fine Science Tools By Dumont | 11252-00 | #5SF (super-fine tips) |
10ml Syringe | Beckton-Dickinson | 301029 | |
Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |