अलगाव और संस्कृति वयस्क माउस सेल संकेतन के लिए cardiomyocytes और की<em> इन विट्रो</em> कार्डियक hypertrophy
Summary
हम वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की एक किस्म से कार्यात्मक वयस्क cardiomyocytes की संस्कृति के लिए एक सुसंगत परिणाम अर्जित करता है.
Abstract
तकनीकी विकास ट्रांसजेनिक और जीन पीटा चूहों, कई अनुसंधान के क्षेत्र में एक अनिवार्य उपकरण सहित, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों बना दिया है. वयस्क cardiomyocytes व्यापक रूप से एक अच्छा हृदय सेलुलर फिजियोलॉजी और pathophysiology के लिए मॉडल है, साथ ही दवा हस्तक्षेप के लिए के रूप में स्वीकार कर रहे हैं. आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की वजह से cardiomyocytes 'टर्मिनल भेदभाव करने के लिए अक्षम हैं जो वांछित जीनोटाइप, उत्पन्न करने के लिए जटिल cardiomyocyte संक्रमण प्रक्रियाओं के लिए की जरूरत रोकना. उच्च मात्रा और गुणवत्ता कार्यात्मक cardiomyocytes के अलगाव और संस्कृति नाटकीय रूप से हृदय अनुसंधान लाभ और संकेतन सेल पारगमन अनुसंधान और दवा के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करेगा. यहाँ, हम छोटे प्रशिक्षण के साथ लागू किया जा सकता है कि वयस्क माउस cardiomyocytes के अलगाव के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि का वर्णन. माउस दिल excised और एक अलग दिल प्रणाली को cannulated है, तो एक कैल्शियम मुक्त और उच्च पी के साथ perfusedotassium Langendorff प्रतिगामी छिड़काव मोड में प्रकार द्वितीय collagenase पाचन द्वारा पीछा बफर. इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की एक किस्म से कार्यात्मक वयस्क चूहे cardiomyocytes के संग्रह के लिए एक सुसंगत परिणाम अर्जित करता है.
Introduction
Cardiomyocytes proliferative नहीं हैं. एच. एल -1 और माउस आलिंद ट्यूमर से प्राप्त एटी-1 कोशिकाओं की तरह कुछ आलिंद cardiomyocyte सेल लाइनें नहीं हैं; हालांकि, शोध के लिए उपलब्ध नहीं वयस्क निलय cardiomyocyte सेल लाइनें हैं. वयस्क माउस cardiomyocytes की प्राथमिक सेल संस्कृतियों सेलुलर और आणविक स्तर पर हृदय अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करते हैं. तिथि करने के लिए, वे जैव रासायनिक शारीरिक, और औषधीय अनुसंधान 1 के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लगातार उपयोग cardiomyocyte अलगाव के प्रभावी तरीकों जरूरी हो गया है. शुद्ध कल्चर अन्य अंगों के साथ बातचीत से मुक्त परिस्थितियों और ऐसे अंतर्जात neurohormonal और हार्मोन की तरह कारकों 2,3 के माध्यम के रूप में प्रणालीगत संचलन के लिए अनुमति देता है. हालांकि, cardiomyocytes के सफल अलगाव चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
हम साथ साथ परिचय प्रोटोकॉल वयस्क चूहे cardiomyocyt साथ अपने अनुभवों पर आधारित हैतों और O'Connell एट अल 4,5 द्वारा वर्णित विधि. विशेष रूप से 2007 5 में, वे सेल संस्कृति और कार्यात्मक परख करने के लिए बफर तैयारी से विस्तृत तकनीकों का वर्णन किया. माउस myocytes चूहे cardiomyocytes की तुलना contracture को अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं, माउस प्रोटोकॉल में छिड़काव, पाचन, सीए 2 + सहनशीलता, चढ़ाना और संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया buffers या मीडिया, एक nonspecific उत्तेजना संकुचन युग्मन अवरोध करनेवाला, 2 के साथ पूरक हैं उनके सहज संकुचन को बाधित करने के लिए 3 Butanedione monoxime (BDM), इसलिए व्यवहार्यता और छड़ के आकार myocytes की उपज में काफी सुधार होगा. यहां पेश प्रोटोकॉल में, myocytes प्रकार द्वितीय collagenase साथ संशोधित Langendorff छिड़काव द्वारा पृथक दिल से एक उच्च पोटेशियम बफर में अलग हो रहे हैं. Collagenase द्वितीय प्रभावी ढंग कहनेवाला मैट्रिक्स और विज्ञप्ति कोशिकाओं टूट जाती है. छिड़काव समाधान भी एक कम स्तर 6 पर सेलुलर चयापचय रहता है. Additi मेंपर, हम यहां इस्तेमाल हार्वर्ड उपकरण से पृथक हृदय प्रणाली सटीक तापमान और लगातार दबाव नियंत्रण 7 के लिए अच्छी तरह से डिजाइन है. यह दृष्टिकोण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की तैयारी और हृदय hypertrophic assays के लिए संकेत प्रोटीन या 2-3 दिन संस्कृति को मापने के लिए रातोंरात संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है जो एकल कक्ष प्रकार की वर्दी आबादी प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे अच्छी तैयारी के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) तुरंत छांटना के बाद प्रवेशनी के लिए माउस दिल को hooking; 2) उपयुक्त दिल छिड़काव. इसके अलावा, कि पानी की गुणवत्ता, छिड़काव तापमान, बफर का पीएच, नसबंदी, रासायनिक पवित्र?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान HL-36573 द्वारा समर्थित किया गया. हम इस पांडुलिपि संपादन के लिए श्री डेविड सोवा धन्यवाद.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
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