분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em> 시험관</em> 심장 비대
Summary
우리는 성인 마우스 심근의 분리를 위해 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 심근의 문화에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.
Abstract
기술의 발전은 유전자 변형과 유전자 녹아웃 마우스, 많은 연구 분야에서 필수적인 도구를 포함하여, 유 전적으로 변형 된 쥐를 만들었습니다. 성인 심근 널리 좋은 심장 세포 생리학 및 병태 생리에 대한 모델뿐만 아니라 제약의 개입으로 사용할 수 있습니다. 유전자 변형 마우스에 의한 심근 '말단 분화 비효율적 원하는 유전자형을 생성하는 복잡한 심근 감염 프로세스에 대한 필요성을 배제. 높은 수량과 품질 기능 심근의 분리 및 문화 극적으로 심장 혈관 연구를 혜택을 세포 신호 전달 연구 및 약물 개발을위한 중요한 도구를 제공합니다. 여기에서, 우리는 약간의 훈련으로 구현 될 수있는 어른 쥐의 심근 세포의 분리를 위해 잘 확립 된 방법을 설명합니다. 마우스 마음이 절제와 격리 된 심장 시스템에 유관 된 다음 칼슘이없는 높은 P와 관류otassium 랑겐 역 행성 관류 모드에서 유형 II 콜라게나 소화 다음 버퍼. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 마우스 심근의 컬렉션에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.
Introduction
심근 증식하지 않습니다. HL-1 및 마우스 심방 종양 유래 AT-1 세포와 같은 일부 심방 심근 세포주가있다; 그러나, 연구에는 성인 심실 심근 세포주가 없다. 성인 마우스 심근의 기본 세포 배양은 세포 및 분자 수준에서 심장 연구를위한 강력한 모델을 제공합니다. 지금까지, 그들은 생화학 생리 및 약리학 적 연구 1에 광범위하게 사용되어왔다. 또한, 유전자 변형 생쥐의 빈번한 사용은 심근 분리의 효과적인 방법을 필요하게되었다. 순수 배양은 다른 기관과의 상호 작용이없는 상태와 같은 내인성 신경 호르몬 및 호르몬과 같은 요인에 2,3를 통해 같은 전신 순환 할 수 있습니다. 그러나 심근을 성공적으로 격리 도전하실 수 있습니다.
우리가 여기에서 소개하는 프로토콜은 성인 쥐 cardiomyocyt와 우리의 경험을 기반으로합니다에스 오코넬 등 4,5에서 설명하는 방법. 특히 2007 5, 그들은 세포 배양 및 기능 분석에 버퍼 준비에서 자세한 방법을 설명했다. 마우스의 근육 세포가 쥐의 심근에 비해 구축에 매우 민감하기 때문에, 마우스 프로토콜의 관류, 소화, 칼슘 2 + 관용, 도금 및 문화에 사용되는 버퍼 나 미디어는 비특이적 여기 수축 커플 링 억제제, 2 보충된다 자신의 자발적인 수축을 억제하는 3 – 부탄의 monoxime (BDM)가, 따라서 생존과 막대 모양의 근육 세포의 수율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 여기에 소개 된 프로토콜에서 근육 세포는 타입 II 콜라와 수정 랑겐 재관류에 의해 고립 된 마음에서 고 칼륨 버퍼에 구분됩니다. 콜라게나 II 효과적으로 간 매트릭스 해제 세포를 분해. 관류 솔루션은 낮은 레벨 6에서 세포의 신진 대사를 유지합니다. 책상 외에도에서에, 우리는 여기에 사용 된 하버드 장치에서 분리 된 심장 시스템은 정확한 온도와 일정한 압력 제어 7 잘 설계되어 있습니다. 이러한 접근법은 높은 재현성 제제 및 심장 비대 분석법위한 신호 단백질 또는 2~3일 배양을 측정 밤새 배양에 사용할 수있는 단일 셀 타입의 균일 한 집단을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최선의 준비를 위해, 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 즉시 절제 후 정맥에 마우스 마음을 접선; 2) 적절한 심장 관류. 또한, 물 품질, 관류 온도, 버퍼의 산도, 살균, 화학 순도, 깨끗하고 오염되지 않은 튜브와 챔버도 중요한 요소를 확인합니다. 18.2 mΩ의 분자 생물학 수준의 H 2 O는 높은 버퍼를 준비하는 것이 좋습니다. 200 mM의 ATP 스톡 용액의 pH는 7.2, 쉽게 놓치는 단계로 조정되어야한다.
…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 부여 HL-36573에 의해 지원되었다. 우리는이 원고를 편집 데이비드 씨 Sowa의 감사합니다.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
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