العزلة وثقافة الكبار ماوس العضلية للاشارة الخليوي و<em> في المختبر</em> تضخم القلب
Summary
نحن تصف طريقة موثوق بها لعزل العضلية الماوس الكبار. هذا البروتوكول تعطي نتيجة متسقة لثقافة الكبار العضلية وظيفية من مجموعة متنوعة من الفئران المعدلة وراثيا.
Abstract
جعلت التطورات التكنولوجية الفئران المعدلة وراثيا، بما في ذلك المعدلة وراثيا والفئران خروج المغلوب الجينات، وأداة أساسية في العديد من المجالات البحثية. تحظى بقبول واسع العضلية الكبار كنموذج جيد للالفيزيولوجيا الخلوية القلب والفيزيولوجيا المرضية، فضلا عن التدخل الصيدلانية. الفئران المعدلة وراثيا يحول دون الحاجة إلى عمليات العدوى cardiomyocyte معقدة التركيب الوراثي لتوليد المرجوة، والتي هي غير فعالة نظرا لتمايز محطة العضلية. سوف العزلة وثقافة كمية عالية الجودة والعضلية وظيفية تستفيد بشكل كبير بحوث القلب والأوعية الدموية، وتوفير أداة مهمة للإشارة الخلية البحوث والتنمية تنبيغ المخدرات. هنا، نحن تصف طريقة راسخة لعزل العضلية الماوس الكبار التي يمكن تنفيذها مع قليل من التدريب. يتم استئصاله قلب الفأر ومقنى إلى نظام القلب معزولة، ثم مع perfused ع خالية من الكالسيوم وعاليةotassium العازلة تليها النوع الثاني كولاجيناز الهضم في وضع Langendorff نضح الوراء. هذا البروتوكول تعطي نتيجة متسقة لجمع الوظيفية العضلية الماوس الكبار من مجموعة متنوعة من الفئران المعدلة وراثيا.
Introduction
العضلية ليست التكاثري. هناك بعض خطوط الخلايا cardiomyocyte الأذيني، مثل HL-1 و AT-1 الخلايا المشتقة من الأورام الأذيني الماوس؛ ومع ذلك، لا توجد البطين الكبار cardiomyocyte خطوط الخلايا المتاحة للبحوث. مزارع الخلايا العضلية الأولية من الماوس الكبار تقدم نموذجا قويا للأبحاث القلب على المستويات الخلوية والجزيئية. حتى الآن، كانت قد استخدمت على نطاق واسع لالبيوكيميائية والفسيولوجية والدوائية والبحوث 1. بالإضافة إلى ذلك، فإن الاستخدام المتكرر من الفئران المعدلة وراثيا وقد استلزم أساليب فعالة من cardiomyocyte العزلة. يسمح ثقافة نقية لظروف خالية من التفاعل مع أجهزة أخرى والدوران الجهازي، مثل من خلال العوامل الهرمونية العصبية والهرمونات مثل الذاتية 2،3. ومع ذلك، والعزلة الناجح العضلية يمكن أن يكون تحديا.
ويستند البروتوكول ونحن نقدم هنا على تجاربنا مع cardiomyocyt الفئران الكباروفاق وطريقة وصفها أوكونيل وآخرون 4،5. وخاصة في عام 2007 5، وصفوه تقنيات مفصل من الاستعدادات عازلة لزراعة الخلايا وفحص وظيفية. منذ myocytes الماوس هي عرضة للانكماش مقارنة العضلية الفئران، وتستكمل المخازن المؤقتة أو وسائل الإعلام المستخدمة في نضح، والهضم، كا 2 + تسامح، والطلاء والثقافة في بروتوكول الماوس مع غير محدد الإثارة، تقلص اقتران المانع، 2، 3 Butanedione monoxime (بي دي إم) لمنع الانكماش لعفوية، وبالتالي الجدوى والعائد من myocytes على شكل قضيب تحسن إلى حد كبير. في البروتوكول قدم هنا، يتم فصل myocytes في منطقة عازلة البوتاسيوم عالية من القلب معزولة عن طريق تعديل نضح Langendorff مع النوع الثاني كولاجيناز. كولاجيناز الثاني فواصل بفعالية أسفل المصفوفة بين الخلايا والخلايا النشرات. يبقي الحل نضح أيضا الأيض الخلوي عند مستوى منخفض 6. في additiعلى، ونظام القلب معزولة عن جهاز هارفارد كنا هنا هو مصممة تصميما جيدا لدرجة حرارة محددة وثابتة السيطرة على ضغط 7. ويوفر هذا النهج الاستعدادات تكرار للغاية والسكان موحدة من نوع خلية واحدة، والتي يمكن استخدامها في الثقافة بين عشية وضحاها لقياس إشارات البروتينات أو الثقافة 2-3 اليوم لفحوصات القلب الضخامي.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحصول على أفضل إعداد، الخطوات الأكثر أهمية هي: 1) ربط سرعان ما قلب الماوس إلى قنية بعد الاستئصال؛ 2) نضح القلب المناسبة. أيضا، لاحظ أن نوعية المياه ودرجة الحرارة التروية، ودرجة الحموضة من العازلة، والتعقيم، ونقاء الكيميائية، ونظيفة، وأنابيب وغرف غير الملوثة هي أيضا من العوامل ا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد منحة HL-36573. نشكر السيد ديفيد سوا لتحرير هذه المخطوطة.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R., Gross, D. R. . Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
