Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em> In vitro</em> Hypertrofie
Summary
We beschrijven een betrouwbare methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor de cultuur van functionele volwassen hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.
Abstract
Technologische vooruitgang heeft genetisch gemodificeerde muizen gemaakt, met inbegrip van transgene en knockout muizen, een essentieel instrument in veel onderzoeksgebieden. Volwassen hartspiercellen zijn algemeen aanvaard als een goed model voor hart cellulaire fysiologie en pathofysiologie, en voor farmaceutische interventie. Genetisch gemodificeerde muizen weg aan de behoefte aan ingewikkelde cardiomyocyte infectie processen om de gewenste genotype, die inefficiënt door terminale differentiatie hartspiercellen 'te genereren. Isolatie en cultuur van hoge kwaliteit en kwantiteit functionele cardiomyocyten zal drastisch profiteren cardiovasculair onderzoek en een belangrijk instrument voor cell signaling transductie onderzoek en ontwikkeling van geneesmiddelen. Hier beschrijven we een bekende methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen die met weinig training kan worden uitgevoerd. De muis hart is uitgesneden en gecanuleerde om een geïsoleerd hart systeem, dan perfusie met een calcium-vrije en hoge potassium buffer gevolgd door type II collagenase vertering in Langendorff retrograde perfusie modus. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor het verzamelen van functionele volwassen muis hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.
Introduction
Cardiomyocyten niet proliferatieve. Er zijn een aantal atriale cardiomyocyt cellijnen, zoals HL-1 en OP-1 cellen afkomstig van muizen atriale tumoren; er zijn echter geen volwassen ventriculaire cardiomyocyte cellijnen voor onderzoek beschikbaar. Primaire celculturen van volwassen muis hartspiercellen een krachtig model voor hart-onderzoek op cellulair en moleculair niveau. Tot op heden hebben zij uitgebreid gebruikt voor biochemische, fysiologische en farmacologische onderzoek 1. Bovendien, het veelvuldig gebruik van genetisch gemodificeerde muizen noodzakelijk doeltreffende methoden cardiomyocyt isolatie. Reincultuur maakt omstandigheden vrij van interactie met andere organen en de systemische circulatie, bijvoorbeeld door endogene neurohormonale en hormoonachtige factoren 2,3. Echter, succesvolle isolatie van hartspiercellen uitdaging zijn.
Het protocol we hierin stellen, is gebaseerd op onze ervaringen met volwassen rat cardiomyocytes en de door O'Connell et al. 4,5 methode. Vooral in 2007 5, beschreven ze gedetailleerde technieken uit buffer voorbereidingen om celcultuur en functionele test. Aangezien muis myocyten zijn zeer gevoelig voor contractuur opzichte van de cardiomyocyten van de rat, worden de buffers of media die voor de perfusie, spijsvertering, Ca 2 + tolerantie, plating en cultuur in de muis protocol aangevuld met een niet-specifieke excitatie-contractie koppeling remmer, 2, 3-butaandion monoxime (BDM) om hun spontane contractie remmen, vandaar de levensvatbaarheid en de opbrengst van staafvormige myocytes aanzienlijk verbeteren. In het protocol hier geïntroduceerd, worden de myocytes in een hoog kaliumgehalte buffer van het geïsoleerde hart gescheiden door gewijzigde Langendorff perfusie met collagenase type II. Collagenase II effectief breekt de intercellulaire matrix en releases cellen. De perfusie oplossing houdt ook cellulaire stofwisseling op een laag niveau 6. In additiop, het geïsoleerde hart systeem van Harvard Apparatus we hier gebruikt wordt is goed ontworpen voor een nauwkeurige temperatuur en constante druk 7. Deze benadering levert reproduceerbare preparaten en uniforme populaties van enkele celtype, dat kan worden gebruikt voor het meten nachtkweek signaaleiwitten of 2-3 dagen cultuur cardiale hypertrofische assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor de beste voorbereiding, de meest kritische stappen: 1) direct aansluiten van de muis hart naar de canule na excisie; 2) passende hart perfusie. Merk ook op dat de waterkwaliteit, perfusie temperatuur, pH buffer, sterilisatie, chemische zuiverheid en schone, niet-verontreinigde buizen en kamers zijn ook belangrijke factoren. 18.2 mQ moleculaire biologie-grade H 2 O wordt sterk aanbevolen voor buffer voorbereiding. De pH van 200 mM ATP voorraadoplossing worden ingesteld op 7,2, een stap die gemakkelijk gemist.
H…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Wij danken de heer David Sowa voor het bewerken van dit manuscript.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R., Gross, D. R. . Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
