Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em> In-vitro-</em> Herzhypertrophie
Summary
Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.
Abstract
Technologische Fortschritte haben genetisch veränderte Mäuse, einschließlich transgener und Gen-Knockout-Mäusen, ein wesentliches Instrument in vielen Forschungsfeldern. Adulte Kardiomyozyten sind weit verbreitet als ein gutes Modell für die Herzzellphysiologie und Pathophysiologie sowie für pharmazeutische Intervention angenommen. Genetisch veränderte Mäuse, schließen die Notwendigkeit für komplizierte Kardiomyozyten Infektionsprozessen, um den gewünschten Genotyp, was ineffizient aufgrund der terminalen Differenzierung Kardiomyozyten 'sind zu generieren. Isolation und Kultur von hoher Quantität und Qualität funktionellen Kardiomyozyten wird dramatisch profitieren Herz-Kreislaufforschung und ein wichtiges Instrument für die Zellsignalübertragung Forschung und Wirkstoffentwicklung. Hier beschreiben wir eine gut etablierte Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus, die mit wenig Training umgesetzt werden können. Die Maus Herz herausgeschnitten und zu einem isolierten Herzsystem Kanüle, dann mit einem Calcium-frei und hoch p blutetenotassium Puffer, gefolgt von Typ-II-Kollagenase-Verdauung im Langendorff-Modus retrograde Perfusion. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Sammlung von Funktions erwachsenen Maus Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.
Introduction
Kardiomyozyten sind nicht proliferativen. Es gibt einige atrialen Kardiomyozyten-Zelllinien, wie HL-1 und AT-1 Zellen von Maus Vorhof Tumoren abgeleitet sind; jedoch gibt es keine Erwachsenen ventrikulären Kardiomyozyten Zelllinien für die Forschung zur Verfügung. Primärzellkulturen von adulten Maus Kardiomyozyten eine leistungsstarke Modell für Herzforschung auf zellulärer und molekularer Ebene. Bisher sie weitgehend für biochemische, physiologische und pharmakologische Forschung 1 verwendet wurden. Darüber hinaus hat die häufige Verwendung von genetisch veränderten Mäusen effektive Methoden der Kardiomyozyten-Isolation notwendig. Kultur pur ermöglicht Bedingungen frei von Wechselwirkungen mit anderen Organen und den systemischen Kreislauf, zB durch endogene neurohormonalen und hormonähnlichen Faktoren 2,3. Allerdings kann erfolgreiche Isolierung von Kardiomyozyten Herausforderung sein.
Das Protokoll wir hier vorstellen wird auf unseren Erfahrungen mit erwachsenen Ratte cardiomyocyt Basisn und die von O'Connell et al 4,5 beschriebenen Methode. Vor allem im Jahr 2007 5 beschrieben sie detaillierte Techniken aus Puffer Vorbereitungen zur Zellkultur-und Funktionstest. Seit Muskelzellen der Maus sind sehr anfällig für Kontraktur im Vergleich zu den Ratten-Herzmuskelzellen, werden die Puffer oder Medien für die Durchblutung, Verdauung, Ca 2 + Duldung, Beschichtung und Kultur in der Maus-Protokoll verwendet, mit einer unspezifischen Erregung und Kontraktion Kopplung Inhibitor, 2 ergänzt, 3-Butandion Monoxim (BDM), um ihre spontane Kontraktion hemmen, daher die Rentabilität und den Ertrag von stabförmigen Muskelzellen deutlich verbessern. In der hier vorgestellten Protokoll werden die Muskelzellen in einem hohen Kalium-Puffer aus dem isolierten Herzen durch modifizierte Langendorff-Perfusion mit Kollagenase Typ II getrennt. Collagenase II effektiv bricht die interzelluläre Matrix und gibt Zellen. Die Perfusion Lösung hält auch den Zellstoffwechsel auf niedrigem Niveau 6. In additiauf das isolierte Herz System von Harvard Apparatus verwendeten wir hier für eine präzise Temperatur-und Konstantdruckregelung 7 gut entwickelt. Dieser Ansatz bietet hoch reproduzierbare und gleichmäßige Zubereitungen Populationen Zelltyp, der in Übernachtkultur zum Messen Signalproteine oder 2-3 Tage alten Kultur für Herzhypertrophie Assays verwendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die beste Vorbereitung, sind die wichtigsten Schritte: 1) unverzüglich Anschließen der Maus Herz mit der Kanüle nach der Exzision; 2) geeignete Herzdurchblutung. Beachten Sie auch, dass die Wasserqualität, die Durchblutung Temperatur, pH-Puffer, Sterilisation, chemische Reinheit und sauber, nicht kontaminierte Rohre und Kammern sind ebenfalls wichtige Faktoren. 18,2 mOhm Molekularbiologie-Grade-H 2 O ist sehr für Puffer Vorbereitung empfohlen. Der pH-Wert von 200 mM ATP Stammlösung sollte auf 7,2, ein Schritt, der leic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute Zuschuss HL-36573 unterstützt. Wir danken Herrn David Sowa für die Bearbeitung dieses Manuskript.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
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