Isolasjon og kultur av voksne musen Cardiomyocytes for Cell Signaling og<em> In vitro</em> Cardiac Hypertrofi

Summary

Vi beskriver en pålitelig metode for isolering av voksen mus kardiomyocytter. Denne protokollen gir et konsistent resultat for kulturen i funksjonelle voksne cardiomyocytes fra en rekke genmodifiserte mus.

Abstract

Teknologiske fremskritt har gjort genmodifiserte mus, herunder genmodifiserte og genet knockout mus, et viktig verktøy i mange forskningsfelt. Voksen cardiomyocytes er allment akseptert som en god modell for hjerte cellulær fysiologi og patofysiologi, så vel som til farmasøytisk intervensjon. Genetisk modifiserte mus utelukker behovet for kompliserte cardiomyocyte infeksjonsprosesser for å generere den ønskede genotype, som er ineffektive på grunn av kardiomyocytter 'terminal differensiering. Isolasjon og kultur av høy kvantitet og kvalitet funksjonelle cardiomyocytes vil dramatisk nytte kardiovaskulær forskning og gi et viktig verktøy for cellesignale transduksjon forskning og legemiddelutvikling. Her beskriver vi en veletablert metode for isolering av voksne mus kardiomyocytter som kan gjennomføres med lite trening. Musen Hjertet ble skåret ut og kanylert til et isolert hjerte-system, og deretter perfusert med et kalsium-fritt og høy potassium buffer etterfulgt av type II collagenase fordøyelsen i Langendorff retrograd perfusjon modus. Denne protokollen gir et konsistent resultat for innsamling av funksjonelle voksen mus cardiomyocytes fra en rekke genmodifiserte mus.

Introduction

Cardiomyocytes er ikke proliferativ. Det er noen atriale cardiomyocyte cellelinjer, som HL-1 og AT-1-celler avledet fra muse atriale tumorer; men det er ingen voksen ventrikkel cardiomyocyte cellelinjer som er tilgjengelige for forskning. Primære cellekulturer fra voksne mus kardiomyocytter gi en kraftig modell for hjerteforskning på cellulært og molekylært nivå. Hittil har de vært brukt mye for biokjemiske, fysiologiske, og farmakologisk forskning ^en. I tillegg har den hyppige bruken av genmodifiserte mus nødvendig effektive metoder for cardiomyocyte isolasjon. Ren kultur tillater betingelser fri for interaksjon med andre organer og den systemiske sirkulasjon, for eksempel gjennom endogene neurohormonal og hormon-lignende faktorer ^2,3. Imidlertid kan vellykket isolering av kardiomyocytter være utfordrende.

Protokollen vi introdusere her er basert på våre erfaringer med voksen rotte cardiomyocytes og fremgangsmåten beskrevet av O'Connell et al ^4,5. Spesielt i 2007 ^5, beskrives de detaljerte teknikker fra buffermidler til cellekultur og funksjonelt assay. Siden muse myocytes er svært utsatt for kontraktur i forhold til de rotte cardiomyocytes, blir buffere eller mediene som brukes for perfusjon, fordøyelse, Ca ^{2 +} toleranse, platekledning og kultur i musen protokollen supplert med en uspesifikk eksitasjon-kontraksjon kopling inhibitor, 2, 3-butandion monoxime (BDM) for å hemme deres spontan sammentrekning, derav levedyktighet og utbytte av stavformede myocytes forbedres vesentlig. I protokollen innføres her, er myocytes separeres i en høy kaliumbuffer fra det isolerte hjertet ved modifisert Langendorff perfusjon med type II kollagen-ase. Kollaqenase II bryter effektivt ned inter matrise og frigjør cellene. Perfusjon løsningen holder også cellenes stoffskifte på et lavt nivå ^seks. I tilpå, er den isolerte hjertet system fra Harvard Apparatus vi brukte her godt designet for nøyaktig temperatur og konstant trykkregulering ^7. Denne fremgangsmåten gir svært reproduserbare preparater og ensartede populasjoner av enkeltcelletype, som kan brukes i over natten kultur for å måle signal proteiner eller 2-3 dagers kultur for kardiale hypertrofiske assays.

Protocol

All forskning på mus ble gjort i henhold til prosedyrer og retningslinjer av National Institutes of Health, og protokollene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Toledo, College of Medicine og biovitenskap. En. Perfusjonssystem Forberedelse Dagen før isolasjon, fylle hele perfusjon systemet (inklusive reservoarer) med en oppløsning av fast basisk rest-fritt vaskemiddel. La løsningen suge inn i systemet i noen timer eller over natten. …

Representative Results

En. Vellykket Isolation Kvantifisering To kriterier er benyttet for å kvantifisere suksessen av isolerings: for det første det totale antall cardiomyocytes isolert, og for det andre forholdet mellom stavformede kalsiumtolerant å runde ikke-tolerante myocytter. Vanligvis denne protokollen tar rundt 75-90 minutter fra hjertet fjerning til myocyte plating og rentene rundt 1 million stavformede Cardiomyocytes (70-90% av totale myocytes høstet) fra en voksen mus hjerte. Dette kan variere med mus…

Discussion

For den beste forberedelsen, de mest kritiske trinnene er: 1) umiddelbart trekke opp muse hjerte til kanylen etter eksisjon; 2) passende hjerte perfusjon. Vær også oppmerksom på at vannkvaliteten, perfusjon temperatur, pH i buffer, sterilisering, kjemisk renhet, og ren, ikke-forurenset tubing og kamre er også viktige faktorer. 18.2 mΩ molekylærbiologi-klasse H ₂ O er sterkt anbefalt for buffer forberedelse. PH i 200 mM ATP stamløsning bør justeres til 7,2, et skritt som er lett savnet.

Det er viktig raskt i…

Materials

Isolated heart system for small rodent	Harvard Apparatus	IHSR-mouse 73-4019
	Aortic Cannula, OD 1.0 mm	Harvard Apparatus	73-2816
Dumont #4 Forceps	Fine science tools	11294-00
Straight sharp serrated scissors	Fine science tools	14070-12
Serrated Graefe forceps	Fine science tools	11050-10
Curved, serrated Graefe forceps	Fine science tools	11052-10
Straight Mini Serrefines clamps	Fine science tools	18054-28
MEM	Gibco	11575-032
Collagenase II	Worthington	4176
Mucosal universal detergent	Sigma	Z637181	Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.