Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em> In vitro</em> A hipertrofia cardíaca
Summary
Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.
Abstract
Os avanços tecnológicos tornaram ratos geneticamente modificados, incluindo transgênicos e camundongos knockout do gene, uma ferramenta essencial em muitos campos de pesquisa. Cardiomiócitos adultos são amplamente aceito como um bom modelo para a fisiologia celular cardíaca e fisiopatologia, bem como para a intervenção farmacêutica. Camundongos geneticamente modificados exclui a necessidade de processos de infecção de cardiomiócitos complicadas para gerar o genótipo desejado, que são ineficientes devido à diferenciação terminal 'cardiomiócitos. Isolamento e cultura de alta quantidade e qualidade cardiomiócitos funcionais irá beneficiar dramaticamente pesquisa cardiovascular e fornecer uma ferramenta importante para a sinalização celular pesquisa transdução e desenvolvimento de medicamentos. Aqui, descrevemos um método bem estabelecido para o isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse que podem ser implementadas com pouco treinamento. O coração do mouse é retirado e canulada a um sistema de coração isolado, então perfundidos com um livre de cálcio e de alto potassium tampão seguido pelo tipo II digestão colagenase em Langendorff modo perfusão retrógrada. Este protocolo produz um resultado consistente para a recolha de cardiomiócitos de rato adulto funcionais a partir de uma variedade de ratinhos geneticamente modificados.
Introduction
Os cardiomiócitos não proliferativa. Existem algumas linhas celulares de cardiomiócitos atriais, como HL-1 e AT-1 de células derivadas de tumores de ratinho atrial; no entanto, não há linhas de células de cardiomiócitos ventriculares adulto disponíveis para pesquisa. Culturas de células primárias de cardiomiócitos adultos rato fornecer um modelo poderoso para a pesquisa do coração nos níveis celulares e moleculares. Até à data, têm sido amplamente utilizados para bioquímicos, fisiológicos e farmacológicos de pesquisa 1. Além disso, o uso frequente de camundongos geneticamente modificados exigiu métodos eficazes de isolamento de cardiomiócitos. Cultura pura permite condições livres de interação com outros órgãos e da circulação sistêmica, como através de fatores endógenos neuro-hormonais e hormônios como 2,3. No entanto, isolamento de cardiomiócitos pode ser um desafio.
O protocolo apresentamos aqui é baseada em nossas experiências com cardiomyocyt rato adultoes e o método descrito por O'Connell et al 4,5. Especialmente em 2007 5, descreveram técnicas detalhadas de preparações de buffer para cultura de células e ensaio funcional. Desde miócitos rato são altamente suscetíveis a contratura em comparação com os cardiomiócitos de ratos, os tampões ou mídia usada para a perfusão, a digestão, Ca 2 + tolerância, chapeamento e cultura no protocolo do mouse são complementadas com um inibidor de acoplamento excitação-contração inespecífica, 2, 3-butanodiona monoxime (BDM) para inibir a contracção espontânea, por conseguinte, a viabilidade e produtividade de miócitos em forma de bastonete, melhorar significativamente. No protocolo introduzido aqui, os miócitos são separados num tampão de alto teor de potássio do coração isolado por perfusão de Langendorff modificado com colagenase tipo II. Colagenase II rompe de forma eficaz para baixo da matriz intercelular e as células libera. A solução de perfusão também mantém o metabolismo celular a um nível baixo 6. Em comum, além, o sistema de coração isolado de Harvard Apparatus usamos aqui é bem projetado para a temperatura precisa e controle de pressão constante 7. Esta abordagem proporciona preparações altamente reprodutíveis e populações uniformes de tipo de célula única, que pode ser utilizado na cultura de uma noite para a medição de proteínas de sinalização ou de cultura de 2-3 dias para ensaios hipertróficas cardíacas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para a melhor preparação, as etapas mais críticas são: 1) imediatamente ligar o coração do mouse para a cânula após a excisão; 2) perfusão do coração apropriada. Além disso, observe que a qualidade da água, temperatura de perfusão, pH de tampão, esterilização, pureza química, e limpo, tubos e câmaras não-contaminados também são fatores importantes. 18,2 mohms biologia molecular grau H2O é altamente recomendado para a preparação buffer. O pH da solução de estoque de 200 mM de ATP deve ser ajustado para …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Agradecemos ao Sr. David Sowa para a edição deste manuscrito.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
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