Выделение и Культура взрослой мыши кардиомиоцитов для клеточной сигнализации и<em> В пробирке</em> Гипертрофия сердца
Summary
Мы описываем надежный способ для изоляции кардиомиоцитов взрослых мышей. Этот протокол дает согласованный результат для культуры функциональных взрослых кардиомиоцитов из множества генетически модифицированных мышей.
Abstract
Технологические достижения сделали генетически модифицированных мышей, в том числе трансгенных и ген мышей с, незаменимого инструмента во многих областях исследований. Взрослые кардиомиоциты получили широкое признание как хорошей моделью для сердечной клеточной физиологии и патофизиологии, а также для фармацевтической вмешательства. Генетически модифицированные мыши исключает необходимость сложных процессов инфекции кардиомиоцитов генерировать искомого генотипа, которые являются неэффективными из-за терминальной дифференцировки кардиомиоцитов. Выделение и культивирование высокого количества и качества функциональных кардиомиоцитов резко пользу сердечно-сосудистой исследования и обеспечить важный инструмент для исследования трансдукции клеточной сигнализации и разработки лекарственных препаратов. Здесь мы описываем устоявшихся метод для изоляции взрослых кардиомиоцитов мышей, которые могут быть реализованы с небольшим опытом. Сердце мыши вырезали и канюлировали в изолированной системе сердца, то перфузии с бескальциевой и высокой рotassium буфер с последующим Тип II коллагеназой в Лангендорфа режиме ретроградной перфузии. Этот протокол дает последовательную результат для сбора функциональных кардиомиоцитов взрослых мышей из различных генетически модифицированных мышей.
Introduction
Кардиомиоциты не пролиферативная. Есть некоторые предсердные кардиомиоциты клеточные линии, как HL-1 и АТ-1 клеток, полученных из мышиных предсердий опухолей; Однако, нет никаких взрослых желудочковая клеточные линии кардиомиоцитов, доступные для исследования. Первичные культуры клеток из взрослых кардиомиоцитов мыши обеспечивают мощную модель для исследования сердца на клеточном и молекулярном уровнях. На сегодняшний день они широко используются для биохимического, физиологического и фармакологического исследования 1. Кроме того, частое использование генетически модифицированных мышей потребовало эффективные методы изоляции кардиомиоцитов. Чистая культура позволяет условиях, свободных от взаимодействия с другими органами и большом круге кровообращения, например, через эндогенных нейрогормональных и гормоноподобных факторов 2,3. Тем не менее, успешная изоляция кардиомиоцитов может быть сложной задачей.
Протокол введем здесь, основана на нашем опыте с взрослой крысы cardiomyocytES и способ, описанный О'Коннелом соавт 4,5. Особенно в 2007 году 5, они описаны подробные приемы из буферных препаратов в культуре клеток и функциональном анализе. С миоциты мыши сильно подвержены контрактуры по сравнению с кардиомиоцитов крыс, буферы или среды, используемые для перфузии, пищеварения, Ca 2 + веротерпимости, обшивки и культуры в протоколе мыши дополняются неспецифического возбуждения-сжатия соединительной ингибитора, 2, 3-бутандион monoxime (БДМ) ингибировать их самопроизвольное сжатие, следовательно, жизнеспособность и выход из стержнеобразных миоцитов значительно улучшить. В протоколе, введенной здесь, миоциты разделяются в высоком буфера калия из изолированного сердца по модифицированной Лангендорфа перфузии Тип II коллагеназы. Коллагеназы II эффективно разрушает межклеточный матрикс и релизы клетки. Решение перфузии также держит клеточный метаболизм на низком уровне 6. В дополнительна, изолированная система сердца из Гарвардского аппарата мы использовали здесь хорошо для точного температуры и постоянного контроля давления 7. Такой подход обеспечивает высокую воспроизводимость препараты и однородные популяции одного типа клеток, которые могут быть использованы в ночной культуры для измерения сигнальных белков или 2-3 дня культуру для сердечных гипертрофических анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для лучшего подготовки, наиболее важными шагами являются: 1) незамедлительно подключения сердце мыши, чтобы канюли после удаления; 2) необходимости сердце перфузии. Кроме того, обратите внимание, что качество воды, температура перфузии, рН буфера, стерилизации, химическую чистоту и чистым, не загря?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным сердца, легких и крови институт Грант HL-36573. Мы благодарим г-на Дэвида Sowa для редактирования эту рукопись.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R., Gross, D. R. . Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
