Aislamiento y cultivo de ratón adulto cardiomiocitos de Señalización Celular y<em> In vitro</em> Hipertrofia Cardíaca
Summary
Se describe un método fiable para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto. Este protocolo se obtiene un resultado coherente para el cultivo de cardiomiocitos adultos funcionales a partir de una variedad de ratones modificados genéticamente.
Abstract
Los avances tecnológicos han hecho que los ratones modificados genéticamente, incluidos los ratones transgénicos y knockout de genes, una herramienta esencial en muchos campos de investigación. Cardiomiocitos adultos son ampliamente aceptados como un buen modelo para la fisiología celular cardiaca y la fisiopatología, así como para la intervención farmacéutica. Ratones genéticamente modificados se oponen a la necesidad de complicados procesos de infección de cardiomiocitos para generar el genotipo deseado, que son ineficientes debido a la diferenciación terminal de los cardiomiocitos. Aislamiento y cultivo de alta cantidad y calidad de los cardiomiocitos funcionales se beneficiarán de manera espectacular la investigación cardiovascular y proporcionar una herramienta importante para la señalización celular investigación transducción y desarrollo de fármacos. Aquí se describe un método bien establecido para el aislamiento de cardiomiocitos adultos de ratón que se pueden implementar con poco entrenamiento. El corazón de ratón se escinde y se canuló a un sistema de corazón aislado, perfundido a continuación, con un p-calcio libre y de altootassium tampón seguido por digestión con colagenasa tipo II en el modo de perfusión retrógrada de Langendorff. Este protocolo produce un resultado coherente para la recogida de los cardiomiocitos de ratón adulto funcionales de una variedad de ratones modificados genéticamente.
Introduction
Los cardiomiocitos no son proliferativa. Hay algunas líneas celulares de cardiomiocitos auriculares, como HL-1 y las células AT-1 derivadas de tumores de ratón auricular; Sin embargo, no hay ventriculares adultos líneas celulares de cardiomiocitos disponibles para la investigación. Cultivos celulares primarios de cardiomiocitos de ratón adulto proporcionan un poderoso modelo para la investigación del corazón en los niveles celulares y moleculares. Hasta la fecha, se han utilizado ampliamente para la bioquímica, fisiológica, farmacológica y la investigación 1. Además, el uso frecuente de ratones modificados genéticamente ha requerido métodos eficaces de aislamiento de cardiomiocitos. Cultivo puro permite condiciones libres de la interacción con otros órganos y la circulación sistémica, tales como a través de factores neurohormonales y similares a las hormonas endógenas 2,3. Sin embargo, el aislamiento exitoso de los cardiomiocitos puede ser un reto.
El protocolo introducimos en este documento se basa en nuestras experiencias con adultos cardiomyocyt rataES y el método descrito por O'Connell et al 4,5. Especialmente en 2007 5, se describen técnicas detalladas a partir de preparaciones de amortiguamiento a cultivo celular y ensayo funcional. Desde los miocitos del ratón son altamente susceptibles a la contractura en comparación con los cardiomiocitos de rata, los tampones o medios utilizados para la perfusión, la digestión, Ca 2 + la tolerancia, la galvanoplastia y la cultura en el protocolo de ratón se complementan con un inhibidor de acoplamiento excitación-contracción no específica, 2, 3-Butanedione monoxima (BDM) para inhibir su contracción espontánea, por lo tanto, la viabilidad y el rendimiento de los miocitos en forma de varilla mejorar significativamente. En el protocolo presentado aquí, los miocitos se separan en un tampón de alto contenido de potasio desde el corazón aislado por perfusión de Langendorff modificada con colagenasa tipo II. La colagenasa II rompe con eficacia por la matriz intercelular y de las células libera. La solución de perfusión también mantiene el metabolismo celular en un nivel bajo 6. En additiencendido, el sistema del corazón aislado de Harvard Apparatus utilizamos aquí está bien diseñado para la temperatura precisa y control de presión constante 7. Este enfoque proporciona preparaciones altamente reproducibles y poblaciones uniformes de solo tipo de células, que se puede utilizar en cultivo durante la noche para la medición de las proteínas de señalización o de cultivo de 2-3 días para los ensayos de hipertróficas cardíacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para la mejor preparación, los pasos más importantes son: 1) conectar rápidamente hasta el corazón del ratón a la cánula después de la escisión; 2) la perfusión del corazón apropiado. Además, tenga en cuenta que la calidad del agua, la temperatura de perfusión, el pH del tampón, la esterilización, la pureza química y limpia tubos y cámaras, no contaminados son también factores importantes. 18.2 mΩ biología molecular de grado H 2 O es muy recomendable para la preparación de buffer. El pH de la solución madre 2…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de subvención HL-36573. Agradecemos al Sr. David Sowa para la edición de este manuscrito.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
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