İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em> In vitro</em> Kalp hipertrofisi
Summary
Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir.
Abstract
Teknolojik gelişmeler transjenik ve gen knockout farelerde, bir çok araştırma alanlarında gerekli bir araç da dahil olmak üzere, genetik olarak modifiye edilmiş fareler yaptık. Yetişkin kardiyomiyositler yaygın iyi bir kalp hücresel fizyoloji ve patofizyolojisi için model yanı sıra ilaç müdahale olarak kabul edilir. Genetik olarak modifiye edilmiş farenin nedeniyle kardiyomiyositlerde 'terminal farklılaşma verimsiz olan arzu edilen genotip oluşturmak için karmaşık kardiyomiyosit enfeksiyon işlemleri için duyulan ihtiyacı ortadan kaldıracak. Yüksek miktar ve kalite fonksiyonel kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü önemli ölçüde kardiyovasküler araştırma yararlanacak ve hücre sinyal iletimi araştırma ve ilaç geliştirme için önemli bir araç sağlayacaktır. Burada, küçük eğitim ile uygulanabilecek yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu için iyi kurulmuş bir yöntemi tarif eder. Fare kalp kesilmiş ve izole edilmiş kalp sistemine kanül, daha sonra, kalsiyum içermeyen ve yüksek p ile perfüzeotassium Langendorff retrograd perfüzyon modu tip II kollajenaz sindirimi ve ardından tampon. Bu protokol, genetiği değiştirilmiş farelerde çeşitli fonksiyonel bir yetişkin fare kardiyomiyositlerin toplanması için tutarlı bir sonuç verir.
Introduction
Kardiyomiyositler proliferatif değildir. HL-1 ve atriyal fare tümörlerinden türetilmiş AT-1 hücreleri gibi bazı atrial kardiyomiyosit hücre çizgileri, vardır; Ancak, araştırma için hiçbir yetişkin ventriküler kardiyomyosit hücre hatları vardır. Yetişkin fare kardiyomiyositlerin birincil hücre kültürleri hücresel ve moleküler seviyede kalp araştırma için güçlü bir model sağlar. Bugüne kadar, bunlar, biyokimyasal, fizyolojik ve farmakolojik araştırmalar 1 için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş farelerin sık kullanılması kardiyomyosit tecrit etkili yöntemler gerektirmiştir. Saf kültür diğer organlar ile etkileşimden şartlar ve bu endojen nörohormonal ve hormon benzeri faktörler 2,3 aracılığıyla gibi sistemik dolaşım sağlar. Ancak, kardiyomiyositlerin başarılı izolasyonu zor olabilir.
Biz burada tanıtmak protokol erişkin sıçan cardiomyocyt ile tecrübelere dayanmaktadıres ve O'Connell ve ark 4,5 tarafından tanımlanan metot. Özellikle 2007 5'de, bu hücre kültürü ve işlevsel tahlil tampon preparatlar ayrıntılı teknikleri tarif. Fare myocytes Sıçan kardiyomiyositlerinde göre kontraktürü son derece duyarlı olduğu için, fare protokolünde perfüzyon, sindirim, Ca 2 + tolerans, kaplama ve kültür için kullanılan tamponlar veya ortamı, spesifik olmayan uyanlma-kasılma bağlama inhibitörü, 2 ile takviye edilmiştir kendiliğinden kasılmasını inhibe 3-Butandion monoxime (BDM), dolayısıyla canlılığı ve çubuk şekilli miyositlerin verimi önemli ölçüde artırır. Burada tanıtılan Protokolde, miyositler tip II kolajenaz ile modifiye edilmiş Langendorff perfüzyonu ile izole edilmiş kalp yüksek potasyum tamponu içinde ayrılır. Kolajenaz II etkili hücrelerarası matrisi ve bültenleri hücreleri ayırır. Perfüzyon çözelti, aynı zamanda düşük bir seviyede 6 hücresel metabolizmayı tutar. Additi yılında, biz burada kullanılan Harvard Apparatus izole kalp sistemi, hassas sıcaklık ve sabit basınç kontrolü 7 için iyi tasarlanmış. Bu yaklaşım, yüksek oranda tekrarlanabilir hazırlıklar ve hipertrofik kalp tahlilleri için sinyal proteinleri ya da 2-3 günlük kültür ölçülmesi için bir gece boyunca kültür içinde kullanılabilecek tek bir hücre tipi, homojen popülasyonları içerir.
Protocol
Representative Results
Discussion
En iyi hazırlanması için, en kritik adımlar şunlardır: 1) derhal çıkarıldıktan sonra kanül fare kalp çengel; 2) uygun kalp perfüzyon. Ayrıca, bu su kalitesini, perfüzyon sıcaklığı, tampon pH, sterilizasyon, kimyasal saflığı ve temiz, kirli olmayan boru ve odaları da önemli faktörlerdir unutmayın. M 18.2 moleküler biyoloji dereceli H 2 O yüksek tampon hazırlanması için özellikle tavsiye edilir. 200 mM ATP stok çözeltisinin pH değeri 7.2, kolaylıkla kaçırılmaz bir adıma ayarlanmalıdır.
…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü Hibe HL-36573 tarafından desteklenmiştir. Biz bu metni düzenlemek için Sayın David Sowa teşekkür ederim.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R., Gross, D. R. . Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
