민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략
Summary
대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.
Abstract
대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 그러나, 현재의 플랫폼은 노동 집약적 샘플 준비, 낮은 검출 한계, 느린 검색 속도, 각 대사 산물에 대한 집중적 인 방법의 최적화 및 긍정적를 모두 측정 할 수 없다는 단일 실험에서 음으로 하전 된 이온과 같은 다른 제한 요인을 보유하고 있습니다. 따라서, 새로운 대사 프로토콜은 대사 체학 연구를 앞당길 수있다. 아미드 계 친수성 크로마토 그래피는 화학 유도체없이 극성 대사 산물 분석을 가능하게한다. Q-Exactive (QE-MS)를 사용하여 고해상도 MS는 이온 광학 향상된 스캔 속도 (해상도 70,000 256 밀리 초)을 증가하고, 양 / 음 전환을 수행하는 기능을 가지고있다. 냉 메탄올 추출 전략을 사용하고, QE-MS와 아미드 열을 결합하는 동시에 추가 기능의 168 대상 극성 대사 물질 및 수천의 강력한 탐지 할 수 있습니다. DAT가공이 매우 효율적인 방식으로 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어로 수행되고, 질량 스펙트럼에서 추출 불명의 특징 데이터베이스에 쿼리 할 수있다.
Introduction
동시에 여러 대사 산물을 측정하는 실험으로 정의 대사는 강렬한 관심의 영역이었다. 대사는 분자 생리학의 직접 판독을 제공하고 암 1-4으로 개발 및 질병에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 핵 자기 공명 (NMR) 및 가스 크로마토 그래피 – 질량 분석법 (GC-MS)은 가장 일반적으로 사용되는 악기 5-9들이다. NMR, 특히 13 C라는 대사 무거운 동위 원소 표지 화합물, 이후 플럭스 실험에 사용 된 10, 11 NMR 활동이다. 그러나,이 전략은 대사에서 해당 응용 프로그램을 제한하는, 상대적으로 높은 샘플의 순도와 큰 샘플의 양을 필요로한다. 한편, NMR에서 수집 된 데이터를 집중 분석하고 복잡한 NMR 스펙트럼의 복합 할당이 곤란합니다. GC-MS는 광범위 극성 지질 대사 연구를 위해 사용되었지만, 그것은 휘발성 compoun을 필요DS 때로는 시간이 소요될 수 있습니다 복잡한 화학을 포함하고 실험적인 노이즈를 소개 대사 때문에 자주 유도체.
셋째 중극은 특성상 단편이나 딸 이온을 선택하는 데 사용되는 동안 삼중 사중 극 질량 분석계에 연결된 액체 크로마토 그래피 (LC)은, 다음 제 중극 조각화되어 본래 부모 이온을 선택하기위한 제 중극을 사용한다. 특정 딸 이온에 부모 이온의 전환을 기록하는이 방법은, 여러 반응 모니터링 (MRM)으로 불린다. MRM은 작은 분자와 단백질 정량 12-15,21 모두에게 매우 민감한 특정하고 강력한 방법입니다. 그러나, MRM은 한계가 있습니다. 높은 특이성을 달성하기 위해 MRM 방법은 각각의 대사에 구축 할 필요가있다. 이 방법은 특정 단편을 식별하고 prope의 사전 지식을 필요로 최적 충돌 에너지를, 대응 이루어져이러한 화학 구조 정보로서 그 대사 산물의 rties. 따라서, 일반적인 조각의 중립적 인 손실을 포함하는 몇 가지 예외를 제외하고,이 방법으로 알 수없는 대사를 식별 할 수 없습니다.
최근 몇 년 동안, 고해상도 질량 분석 (HRMS) 악기는 LTQ-orbitrap 및 Exactive 시리즈, QuanTof로 발표 및 TripleTOF 5600 16-18,22되었습니다. HRMS는 수 ppm의 오차 내에서 그대로 이온의 비율 (M / Z)를 충전하는 질량을 제공 할 수 있습니다. 따라서 모든 프리 커서 이온 (즉, 풀 스캔 모드)를 검출하여 조작 HRMS 악기 정확한 질량 분석의 결과 원소 조성으로부터 직접적인 구조 정보를 얻을 수 있고,이 정보는 잠재적 인 대사를 식별하기 위해 사용될 수있다. 실제로, 화합물에 대한 모든 정보는 구조적 이성질체의 레벨까지, 정확한 질량으로 얻을 수있다. 또한, 전체검사 방법은 대사 산물의 이전 지식을 필요로하지 않습니다 및 방법의 최적화가 필요하지 않습니다. m / z는 스캔 범위에 떨어지는 모든 이온을 분석 할 수 있기 때문에 또한, HRMS는 MRM 방법에 비해 단일 실행 정량화 할 수있는 대사 산물의 수의 측면에서 거의 무제한의 용량을하고있다. HRMS 인해 스캔 전체 MS에서 얻어 질 수있는 데이터 포인트의 수를 비교 결과로 짧은 듀티 사이클에 또한 정량적 용량 삼중 사중 극 MRM에 대등하다. 따라서, HRMS 양적 대사에 대한 대체 방법을 제공합니다. 최근 HRMS의 개선 된 버전 (QE-MS)가 검출 영역 (19)을 확장 한 방법으로서, 충분히 빠른 사이클 시간과 양 및 음의 모드 사이의 전환에 따라 동작 될 수 Q-Exactive 질량 분석법을 칭했다. 여기서 우리는 QE-MS를 사용하여 우리의 대사 전략을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜을 이용하여 세포의 성공적인 대사 산물 프로파일 링을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 성장 배지와 세포의주의 추출을 제어하는 단계; 2) 정량 피크 걸쳐 충분한 (보통 적어도 10) 데이터 포인트가되도록 MS 방법 설정에 근거 LC 방법을 조정하는 단계; 3) 샘플을 실행하기 전에 낮은 질량 교정을하고; 4) 이동 유지 시간을 피하기 위해 더 이상 5 이상 ㎖에 주입 피크 폭이 넓?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 질량 교정 및 데이터 처리에 대한 가치있는 토론을위한 데틀 레프 슈만, 제니퍼 서튼 (써모 피셔 과학)와 나다니엘 스나이더 (펜실베니아 대학)을 인정하고 싶습니다. 이 책에서보고 된 연구는 상 수 R00CA168997에서 건강의 국립 연구소의 국립 암 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Positive calibration mix | Thermo Scientific | #88323 | It is light sensitive. Store at 4 °C |
| Negative calibration mix | Thermo Scientific | #88324 | Store at 4 °C |
| Diazinon | Sant Cruz Biotechnology | #C0413 | It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 °C |
| H-ESI needle insert | Fisher Scientific | #1303200 | This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged. |
| Xbridge amide column | Waters | #186004860 | Guard column is recommend to increase column lifetime. |
References
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